Ein Organ

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8062 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die kontinuierliche Überwachung der Gewebemikrophysiologie ist ein Schlüsselmerkmal des Organ-on-Chip (OoC)-Ansatzes für das In-vitro-Arzneimittelscreening und die Krankheitsmodellierung. Integrierte Sensoreinheiten sind besonders praktisch für die Überwachung der Mikroumgebung. Allerdings stellen empfindliche In-vitro- und Echtzeitmessungen aufgrund der von Natur aus geringen Größe von OoC-Geräten, der Eigenschaften häufig verwendeter Materialien und der zur Unterstützung der Sensoreinheiten erforderlichen externen Hardware-Setups eine Herausforderung dar. Hier schlagen wir ein Silizium-Polymer-Hybrid-OoC-Gerät vor, das Transparenz und Biokompatibilität von Polymeren im Erfassungsbereich bietet und über die von Natur aus überlegenen elektrischen Eigenschaften und die Fähigkeit verfügt, aktive Elektronik aus Silizium aufzunehmen. Dieses multimodale Gerät umfasst zwei Sensoreinheiten. Die erste Einheit besteht aus einem Floating-Gate-Feldeffekttransistor (FG-FET), der zur Überwachung von pH-Änderungen im Sensorbereich verwendet wird. Die Schwellenspannung des FG-FET wird durch ein kapazitiv gekoppeltes Gate und durch die Änderungen der Ladungskonzentration in unmittelbarer Nähe der Verlängerung des Floating Gates reguliert, das als Messelektrode fungiert. Die zweite Einheit nutzt die Erweiterung des FG als Mikroelektrode, um das Aktionspotential elektrisch aktiver Zellen zu überwachen. Das Layout des Chips und seine Verpackung sind mit Messaufbauten mit mehreren Elektrodenarrays kompatibel, die üblicherweise in elektrophysiologischen Labors verwendet werden. Die multifunktionale Wahrnehmung wird durch die Überwachung des Wachstums von induzierten pluripotenten kortikalen Neuronen aus Stammzellen demonstriert. Unser multimodaler Sensor ist ein Meilenstein in der kombinierten Überwachung verschiedener, physiologisch relevanter Parameter auf demselben Gerät für zukünftige OoC-Plattformen.

Organ-on-Chips (OoCs) sind dynamische Gewebekulturgeräte, die darauf abzielen, die mikrophysiologische Umgebung von Organen in vitro nachzuahmen. Sie wurden eingesetzt, um die Relevanz der Krankheitsmodellierung und die Effizienz der Arzneimittelentwicklung zu steigern1. Die Integration von Mikrofluidik in Chips ist führend auf dem Gebiet der zellchemischen Formulierungsanalyse2, die beispielsweise für die Zytotoxizitätsüberwachung3 und die Tumordiagnostik4 von entscheidender Bedeutung ist. Bei der Rekapitulation von Aspekten der Organphysiologie auf dem Chip sollten jedoch mehrere Aspekte berücksichtigt werden, wie etwa auf Gewebe ausgeübte mechanische Kräfte, elektrophysiologische Signalübertragung zwischen elektrisch aktiven Zelltypen und die Überwachung biologischer Hinweise in der extrazellulären Matrix. Diese Aspekte von OoCs können die Zuverlässigkeit und physiologische Relevanz des Systems verbessern5. In dieser Hinsicht ist die kontinuierliche und Echtzeitüberwachung biologischer Hinweise aus Zellkulturen ohne terminale optische Markierungstechniken von entscheidender Bedeutung. Daher wird die Integration mehrerer Sensoren in OoCs für Echtzeitmessungen zur Norm, insbesondere für Umweltindikatoren wie pH-Wert oder Sauerstoffgehalt6, wobei die elektrochemische Erfassung besonders praktisch ist. Die Leistung der Sensoreinheiten ist dabei entscheidend. Um die Verstärkung des Ausgangssignals zu erhöhen, ohne dass externe Schaltkreise erforderlich sind, wurden Feldeffekttransistoren (FETs) als elektrochemische Sensoren implementiert, um biochemisch relevante Informationen zu extrahieren7. Abhängig von der Beschichtung der Transistorelektroden wurde eine Selektivität gegenüber bestimmten Analyten nachgewiesen, wie im Fall von ionenempfindlichen FETs (ISFETs). ISFETs werden seit mehr als 50 Jahren zur Erkennung von Ladungsschwankungen eingesetzt8. Allerdings benötigen ISFETs üblicherweise eine externe und sperrige Referenzelektrode, die kaum in die von Natur aus kleinen OoCs-Geräte integriert werden kann. Darüber hinaus basiert die Referenzelektrode normalerweise auf Ag/AgCl und die Ladungsschwankungen in unmittelbarer Nähe können den Kanal „abschalten“9. Darüber hinaus werden FET-basierte Sensoren normalerweise auf nicht transparenten Substraten (z. B. Silizium) hergestellt, was sie für den Einsatz in OoC-Geräten ungeeignet macht10.

Schematische Darstellung des vorgeschlagenen OoC-Geräts mit integrierter multimodaler Erfassung. (a) Skizze der Vorderseite. Rosa Pfeile zeigen elektrische Verbindungen für Floating-Gate-FETs an, die zur Überwachung von pH-Änderungen verwendet werden, sowie die Erweiterung der Floating-Gates, die als Mikroelektroden zur Aufzeichnung der Aktivität von elektrisch aktiven Zellen verwendet werden. (b) Skizze der Rückseite. Auf der Vorderseite werden Elektroden hergestellt und die Polymermembran wird durch Ätzen von Silizium von der Rückseite freigesetzt, wodurch eine wellenartige Struktur zur Aufnahme des zu testenden Analyten entsteht. (c) Skizze eines Sensors mit beschrifteten Anschlüssen. (d) Schematische Darstellung des Ersatzschaltbildes des Geräts bei Verwendung als FG-FET. Kapazitäten aufgrund der elektrischen Doppelschicht werden im Erfassungsbereich als \(C_S\) und \(C_A\) angezeigt. (e) Schematische Darstellung des Funktionsprinzips des FG-FET. Bei einer Änderung der Nettoladung in unmittelbarer Nähe der FG-Erweiterung ändert sich der Arbeitspunkt des Sensors. Diese Änderung kann durch Überwachung des Drain-Stroms des Transistors erkannt werden.

Als Alternative zu diesen Ansätzen wurden organische ladungsmodulierte FETs (OCMFETs) eingeführt. Diese basieren auf Floating Gates und sind biokompatibel und transparent, wodurch sie sich ideal für Zellkultivierungsanwendungen auf Chips eignen9,11,12. In diesem Fall wurden anstelle der externen Referenzelektrode Floating Gates (FGs) kapazitiv mit einem Steuergate (CG) gekoppelt und ohne Anlegen einer Spannung an den FG-Anschluss verwendet, um den Arbeitspunkt des Transistors festzulegen. Der Nachweis des Analyten in unmittelbarer Nähe der Verlängerung der FG-Elektrode wurde durch Ladungsmodulation in Bezug auf die Nettoladung realisiert, was wiederum den Arbeitspunkt des Transistors veränderte. Trotz ihres ausgeprägten Signal-Rausch-Verhältnisses benötigen OCMFETs normalerweise das Anlegen hoher Spannungswerte, um den Transistor „einzuschalten“. Diese Werte können je nach Organmodell die Physiologie der Zelle stören. Darüber hinaus wurden Änderungen des Ausgangssignals aufgrund von Ladungsmodulation auf den Ebenen von nA7,12 gemeldet, was auf eine geringe Empfindlichkeit hinweist.

Hier präsentieren wir ein Silizium-Polymer-Hybrid-OoC-Gerät mit integrierten multimodalen elektrischen (Ladungs- und Feld-)Sensorfunktionen (Abb. 1). Das Gerät kombiniert die überlegene elektrische Leistung von Silizium mit der Biokompatibilität, Weichheit und Transparenz von Polymeren. Der Chip enthält 8 FG-FET-basierte Sensoren, deren Körper und Anschlüsse auf dem peripheren Siliziumrahmen liegen (Abb. 1a). Die Ausdehnung der FGs erstreckt sich über die zentrale suspendierte Polymermembran, die sowohl die Gewebekultur als auch den Erfassungsbereich bildet, um pH-Änderungen in Echtzeit zu verfolgen (Abb. 1b). Obwohl der Chip acht FET-basierte Sensoren enthält, wurde für diese Studie aufgrund der aktuellen Leistungsfähigkeit des maßgeschneiderten mobilen Messaufbaus nur einer der Sensoren zur Verfolgung der pH-Änderungen verwendet. Die geringe Größe des Chips und insbesondere die Größe des Erfassungsbereichs ermöglichen die Überwachung von Änderungen in kleinen mittleren Volumina (\(\sim 30\,\upmu \hbox {L}\)). Darüber hinaus können je nach Terminalauswahl Verlängerungen der FG-Elektroden als Mikroelektroden eingesetzt werden, um die Aktivität elektrogener Zellen wie Neuronen zu überwachen.

Bei dem hier vorgestellten Gerät verfügen FGs nicht über Anschlüsse zum Anlegen einer Spannung; Vielmehr sind sie kapazitiv mit der Umgebung und den Kontrolltoren (CGs) gekoppelt (Abb. 1c). Das erste Steuergate (\(CG_1\)), das sich auf dem Siliziumteil befindet, gibt den Arbeitspunkt des Transistors an, während das zweite CG (\(CG_2\) im Schaltplan) den Stromkreis vervollständigt und mit der Elektrode koppelt. Elektrolytschnittstelle (Abb. 1d). Eine Nettoladungsänderung in unmittelbarer Nähe der Floating-Gate-Erweiterung (auch als Messelektrode bezeichnet) induziert eine Änderung der Schwellenspannung des Transistors und kann als Änderung des Drain-Stroms des Transistors überwacht werden; da die Ladungsmodulation am FG eine entsprechende Polarisation des Dielektrikums des Gates induziert (Abb. 1e). Dieser Transduktionsmechanismus wird an anderer Stelle ausführlich beschrieben9,13 und basiert auch auf der Polarisation der Verlängerung. Obwohl die perfekte Polarisation experimentell nicht erreichbar ist, fließt kein Strom durch die FG-Erweiterung, da der FG nur kapazitiv gekoppelt ist und es keinen Gate-Leckstrom gibt, sodass eine Polarisation möglich ist14.

Herstellung und Verpackung des OoC-Geräts. (a) Hauptschritte bei der Herstellung des Sensors. Der violette Einschub zeigt die Abmessungen des endgültigen Geräts sowie den Querschnitt. (b) Chip-Vorderseite nach Herstellungsschritten und Würfeln. (c) REM-Aufnahme des Chips von der Rückseite. (d) Zusammengebautes und betriebsbereites Gerät. (e) Schematische Darstellung des Zusammenbaus des Chips mit 3D-gedrucktem Well und Halter sowie der maßgeschneiderten Leiterplatte mit zentralem Schnitt für den Zugang zur optischen Bildgebung.

Unter den menschlichen Organen weist das Gehirn wohl die komplexeste Physiologie auf, da es aus vielen verschiedenen Arten von Neuronen und Gliazellen besteht, die auf komplexe Weise miteinander interagieren. Die Überwachung der Aktivität elektrisch aktiver Zellen, vor allem Neuronen, kann zur Identifizierung dysfunktionaler neurobiologischer Mechanismen führen, die den Krankheitsphänotypen zugrunde liegen. Forscher aus interdisziplinären Bereichen verwenden Elektroden für die In-vivo- und In-vitro-Aufzeichnung von Aktionspotentialen15 in verschiedenen Aufbauten, insbesondere Mikroelektrodenarrays (MEAs). MEAs werden normalerweise implementiert, um Hunderte von Neuronen gleichzeitig mit relativ hohem Durchsatz aufzuzeichnen. Dies hat sich als robuste funktionelle Anzeige zur Unterscheidung zwischen gesunden und erkrankten Zuständen erwiesen16. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass MEAs auch für die Entdeckung und Prüfung von Arzneimitteln geeignet sind17,18,19,20. Verschiedene neuronale und gliale Zelltypen können auf MEAs kultiviert werden und komplexe neuronale Netzwerke bilden. Diese neuronalen Netzwerke können Schwingungen mit verschiedenen Frequenzen erzeugen (von 0,05 Hz bis zu Hunderten von Hz21). Es gibt verschiedene Arten von MEA-Geräten, darunter Einweg-22, 3D-Elektroden mit optischer Stimulation23 und statische MEAs, die mit Impedanzspektroskopie in ein Mikrofluidikgerät24 integriert sind, um die Signalextraktion zu optimieren. Hier nutzen wir die Erweiterung der FG-Elektroden als passive Mikroelektroden, um unseren Chip zusätzlich zur bereits beschriebenen Ladungserfassung als MEA-Gerät nutzen zu können.

Reproduzierbarkeit und Standardisierung bei der Herstellung von OoC-Geräten sind für robuste Organmodelle von entscheidender Bedeutung. Daher wurden BiCMOS-basierte Reinraumfertigungsmethoden auf Waferebene verwendet, um Chargen nominell identischer Chips herzustellen25. Der Herstellungsablauf wird im Abschnitt „Methoden“ ausführlich erläutert und die Hauptschritte sind in Abb. 2a dargestellt. Die geringe Größe der Chips ist auf der Vorderseite (Abb. 2b) und der Rückseite (Abb. 2c) zu erkennen. Um die Handhabung von Flüssigkeiten im Erfassungsbereich zu erleichtern, wurden ein 3D-gedruckter Halter und eine Vertiefung oben auf dem Chip montiert (Abb. 2d). Darüber hinaus wurden speziell angefertigte Leiterplatten (PCBs), die mit kommerziell erhältlichen Mikroelektroden-Array-Auslesesystemen kompatibel sind, entwickelt, um die Verpackung der Geräte zu vervollständigen (Abb. 2e). Durch diese Verpackung sind die Chips konform mit der bestehenden Laborinfrastruktur und direkt für Aktionspotentialaufzeichnungen elektrisch aktiver Zellen nutzbar, ohne dass zusätzliche technische Kenntnisse des Endbenutzers erforderlich sind. Darüber hinaus wurde ein maßgeschneiderter, kompakter und mobiler elektronischer Ausleseanalysator entwickelt, um die Portabilität des Geräts zu verbessern und FG-FET-Sensoren in relevanten Umgebungen, z. B. Inkubatoren bei \(37\,\,^, verwenden zu können {\circ}C\) und \(5\%\) \(CO_2\).

Einer der wichtigsten biochemischen Hinweise, die während der Zellkultur überwacht werden müssen, ist der pH-Wert, da Änderungen des pH-Werts durch Produkte des Zellstoffwechsels verursacht werden können. Daher ist der pH-Wert ein Indikator für die Lebensfähigkeit der Zellen sowie für bestimmte Krankheitsphänotypen9,26, da er mit der Versauerung des Mediums zusammenhängt27.

Der pH-Wert ist ein Maß für die Konzentration von Wasserstoffionen (\(H^+\), also Protonen), die hier als Nettoladung modelliert wird. In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene Modelle zur Untersuchung der Aufladung von Oberflächen entwickelt. Hier verwenden wir die elektrische Doppelschicht (EDL) und die Oberflächenbindung geladener Spezies28,29. Dieses Modell basiert sowohl auf der Ortsbindungstheorie als auch auf der elektrischen Doppelschichtkapazität30. In unserem Modell wurden relevante MOSFET-Parameter aus Trockenmessungen der Sensoren mit dem Advanced Design System (ADS) extrahiert, in einen benutzerdefinierten Matlab-Code implementiert und mit den Gleichungen für die elektrische Doppelschicht gekoppelt. Anschließend wurden die Gleichungen für die Dynamik des Floating-Gates und der durch den Elektrolyten gebildeten elektrischen Doppelschicht gelöst.

Da keine direkte Spannung an den FG angelegt wird, sollte die im FG eingefangene Ladung theoretisch konstant bleiben. Aus dem Prinzip der Ladungserhaltung lässt sich eine Ladungsrelation aufstellen7,9,12,14. Die FG-Spannung und damit die Änderung des Drain-Stroms hängen von drei Variablen ab. Die erste Variable ist die Oberflächenladung (\(\sigma _S\)) aufgrund der an \(CG_2\) gekoppelten Elektrolyt-Elektroden-Schnittstelle, die sich auf das Oberflächenpotential am Erfassungsbereich (\(\Psi _0\)) auswirkt. Dies induziert ein Potential \(\Psi _S\) = \(-\Psi _0\) durch das Metall unter der Oxidschicht im Erfassungsbereich. Die zweite Variable bezieht sich auf die gefangene Ladung im FG (\(Q_0\)), und die letzte Variable hängt von \(CG_1\)(Gl. 1) ab. Die Kopplung von \(CG_2\) durch die PDMS-Membran an den FG wurde ebenfalls in die Gleichung einbezogen, obwohl \(C_{PDMS}\) in der Größenordnung von \(\ca. 10^{-16}F\) berechnet wurde. ) und daher vernachlässigbar. Diese Quellen werden für das Endergebnis für die FG-Spannung summiert (Abb. 1d). Darüber hinaus kann man sich das zweite Kontrolltor als Pseudo-Referenzelektrode vorstellen, die mithilfe des planaren Reinraum-Fertigungsablaufs integriert wird (Abb. 2a). Infolgedessen tragen alle Elemente im Schaltkreis als Summe der kapazitiven Kopplungen zur FG-Spannung bei31:

Das \(CG_{2}\) (dargestellt in Abb. 1d) moduliert das Potential an der Sensoroberfläche. Die Gesamtkapazität \(C_{tot}\) umfasst die parasitäre Kapazität zwischen dem FG und dem Siliziumkörper, \(C_{CB}\), die Kapazität der PDMS-Membran, \(C_{PDMS}\) und die Kapazität jeweils der Sensorfläche und der \(CG_1\), \(C_S\) und \(C_{C G_1}\). Das Potential an der Sensoroberfläche \(\Psi _S\) hängt von \(V_{FG}\), das Potential an der EDL \(\Psi _A\) und den entsprechenden Oberflächenladungen \(\sigma _S\) und ab \(\sigma _A\) (Einzelheiten finden Sie im Abschnitt „Methode“). Der Drainstrom im Sättigungsbereich kann aus Änderungen der Schwellenspannung berechnet werden:

Dabei ist \(\beta\) ein Anpassungsparameter, der nach den experimentellen Ergebnissen eingefügt wird (im folgenden Abschnitt erläutert) und \(\alpha\) die Konstante, die den Transistoreigenschaften zugeordnet ist:

Die Bindung verschiedener Ionen und polarer Wassermoleküle an der Oberfläche kann je nach Material auf unterschiedliche Weise erfolgen. Im Matlab-Code haben wir das Oberflächenpotential am Erfassungsbereich für verschiedene Oberflächendissoziationskonstanten charakterisiert und es auf die Spannung des FG und damit auf den Drain-Strom umgesetzt (Abb. 3a). Die Änderung des pH-Werts moduliert die Bildung von Oberflächenladungen und damit die Potenzialänderung am EDL und an der Sensoroberfläche. Diese Änderungen modulieren die Verschiebung der Schwellenspannung und des Drain-Stroms des FET.

(a) Analytisches Modell des Sensors mit unterschiedlichen Dissoziationskonstanten. Das 3D-Diagramm zeigt die Potenzialänderung am EDL in Bezug auf unterschiedliche pH-Werte und Dissoziationskonstanten und die daraus resultierende Änderung des Drainstroms. Experimente mit pH-Kalibrierflüssigkeiten: (b) Aufbau der Echtzeit-pH-Messung. Die mobile Messeinheit wurde mit dem zu testenden Chip verbunden und der resultierende \(I_D\) wurde über eine Bluetooth-Verbindung auf dem Computer überwacht. (c) Kontinuierliche Überwachung von pH-Änderungen (rosa = pH 4, grün = pH 7, blau = pH 9). Die Aufzeichnung zeigt eine höhere Drainstromverschiebung, wenn der Anfangswert im Vergleich zu den anderen im Diagramm angezeigten Signalen höher ist. (d) Sättigungstest auf dem Chip. pH-4- und pH-9-Lösungen mit gleichen Volumina wurden nacheinander ohne Zwischenspülen zugegeben. Die resultierenden \(I_D\)-Werte stimmen miteinander überein, da der resultierende pH-Wert für alle drei Ereignisse gleich ist. (e) Vergleich zwischen analytischer Lösung und experimentellen Daten für den in (c) dargestellten Sensor. Das „X“ stellt den Mittelwert des experimentellen Datensatzes für jede getestete pH-Lösung dar. (f) Sensitivitätsanalyse mit kleinen pH-Abfällen. Der Pfeil stellt die Zunahme der Ansäuerung aufgrund der sequenziellen Zugabe von Flüssigkeit mit pH-Wert 4 dar. Nach unten gerichtete Spitzen entstehen durch den Aufprall der zusätzlichen Flüssigkeit auf den Erfassungsbereich.

Die trockene Charakterisierung der FETs wurde an anderer Stelle beschrieben25. Zur Echtzeitüberwachung unterschiedlicher pH-Werte wurde die native TiO2-Schicht auf den Elektroden als selektive Schicht genutzt und eine kompakte und mobile Messeinheit entwickelt (siehe Abschnitt „Methoden“). Dieses Gerät bietet einen kompakten Aufbau für Echtzeit- und kontinuierliche Messungen. Tragbarkeit und Kompaktheit sind wichtig, da die Messumgebung für OoCs ein Inkubator in einem zellbiologischen Labor sein kann, wo externe Auslesegeräte nicht üblich und unerwünscht sind und daher minimiert werden müssen (Abb. 3b). Vor dem Einbringen der pH-Kalibrierflüssigkeiten wurde der Chip mit entionisiertem (DI) Wasser gespült und anschließend getrocknet. Es ist jedoch zu erwarten, dass aufgrund der Oberflächenbindung eine dünne Schicht von Wassermolekülen auf der Oberfläche verbleibt. Dies kann als Ausgangszustand des Sensors betrachtet werden (Abb. 3c, schwarzes Band). Anschließend wurden markierte Pufferflüssigkeiten mit unterschiedlichen pH-Werten (4, 7 und 9, AVS TITRINORM, BDH Chemicals) mit Hilfe einer Mikropipette (\(\ca. \,30\, \upmu\) in den Sensorbereich eingeführt. )L). Die Reihenfolge der Einbringung der Flüssigkeiten war zufällig, um die Reproduzierbarkeit des getesteten Sensors zu zeigen. Bei aufeinanderfolgenden Messungen zeigten die Daten eine hohe Reversibilität des Sensors, was bedeutet, dass der Sensor nach dem Entfernen der Lösung und dem Spülen mit entionisiertem Wasser innerhalb von Sekunden wieder in seinen Ausgangszustand zurückkehrte, um die nächste Flüssigkeit einzuführen (Abb. 3c). Nach jeder Messung wurde die getestete Flüssigkeit mit einer Mikropipette aus dem Sensorbereich entfernt und der Chip mit entionisiertem Wasser gespült, um den Sensorwert auf seinen Ausgangswert zurückzusetzen. In Abb. 3c sind Spitzen zu beobachten, die durch den Umgang mit DI-Wasser zwischen den Ereignissen verursacht werden. Die durchschnittliche Reaktionszeit des Sensors betrug 5,48 s mit einer Standardabweichung von 1,3 s aus 15 Messungen (Ergänzende Informationen, Abb. S1). Während der Überwachung der Messungen wurde die Reaktionszeit des Sensors aus den Zeitpunkten berechnet, in denen die Messwerte stabil waren, vor und nach der Aktualisierung des pH-Werts der Lösung (Ergänzende Informationen, Abb. S2) und die Mittel- und Standardabweichungswerte wurden in angezeigt Ergänzende Informationen, Abb. S3. Für die Erstellung des Kalibrierungsdatensatzes des Sensors mit bekannten pH-Werten haben wir den Puffer nicht umgewälzt, um eine Kontamination zu vermeiden. Es könnte jedoch sinnvoll sein, die Rezirkulation nach der Erstellung des Kalibrierungsdatensatzes bekannter pH-Werte in Betracht zu ziehen. Hier haben wir ein n-Typ-Gerät (nMOS) gewählt, mit \(V_{CG} = 5V,\) \(V_{DS} = 3V,\) \(V_{SUB} = V_S = 0V\) und \ ({V_{CG_2}} = 3,3 V.\) Es wurde beobachtet, dass die Drain-Stromwerte mit zunehmendem Säuregehalt abnahmen, was mit der Literatur7 übereinstimmt, wo für ein organisches Bauelement vom p-Typ der gleiche Trend in die entgegengesetzte Richtung berichtet wurde. Wir gehen davon aus, dass die stärkere Verschiebung von niedrigeren pH-Werten auf die Polarisation der Sensoroxidschicht zurückzuführen ist, die die entgegengesetzte Ladung der tatsächlich gebildeten Schicht erfasst. Aus den experimentellen Daten schließen wir, dass Drainstromwerte, die Flüssigkeiten mit unterschiedlichem pH-Wert (4, 7 und 9) entsprechen, mit einer Reaktionszeit von einigen Sekunden gemessen werden können (Ergänzende Informationen, Abb. S1). Aus den gemessenen Daten wurde ein Empfindlichkeitswert \(\frac{\Delta I_{D}}{\Delta pH}\) als \(1,5305\frac{\mu A}{pH}\) für die Änderung zwischen pH-Werten erhalten 7 und pH 9 und \(1,3574\frac{\mu A}{pH}\) zwischen pH 7 und pH 4.

Um die Sättigung des Geräts zu testen, ohne den Sensorbereich zu spülen, wurde der pH-9-Puffer nach dem pH-4-Puffer im gleichen Volumen hinzugefügt. Beim ersten Ereignis in Abb. 3d beobachteten wir, dass bei Einführung des pH-4-Puffers der Anstieg des Stroms aufgrund der Zugabe des pH-9-Puffers geringer war, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass die Oberfläche des Erfassungsbereichs bereits vorhanden war größtenteils mit H+-Ionen aus der pH-4-Lösung bedeckt. Als der Sensorbereich gereinigt wurde und zuerst der pH-9-Puffer eingeführt wurde (zweiter und dritter Vorgang), stieg der anfängliche \(I_D\) an und nahm später mit der Zugabe von pH-4-Puffer ab, obwohl die Verschiebung von \(I_D\) war niedriger, wenn sich der Sensor vor dem Einbringen der Flüssigkeit in einwandfreiem Zustand befand. Die resultierenden \(I_D\)-Werte stimmten mit allen drei Ereignissen für denselben endgültigen pH-Wert überein (Abb. 3d, violettes Band). Für die pH-Messung verwendeten wir natives \(TiO_2\) als selektive Schicht32 und die Oberflächendissoziationskonstanten \(pK_A = 8\) und \(pK_B = 4,5\)29,33, um experimentelle Ergebnisse mit dem analytischen Modell zu vergleichen (Abb. 3e). Wir sahen den gleichen Trend bei den Drainstromwerten sowohl für analytische Berechnungen als auch für Experimente (Ergänzungsinformationstabelle 1). Ein Anpassungsparameter (\(\beta = 30\) \(10^{-6}\)A) wurde in das Modell eingeführt und zu den Drain-Stromwerten summiert, um unbekannte Parameter zu berücksichtigen, z. B. die Kapazität der Stern-Schicht aufgrund der elektrische Doppelschicht (berechnet als \(C_{Stern} = 1,078 \cdot 10^{-11}F\) mit den Annahmen basierend auf28), die tatsächliche Dicke von nativem \(TiO_2\) und die eingeschlossene Ladung im Inneren FG.

Schließlich wurden unter Verwendung eines weiteren n-MOS-FG-FET auf einem separaten Chip kleinere Änderungen des pH-Werts durch sequentielle Zugabe von 2 und 3 \(\upmu \hbox {L}\) pH-4-Puffer aufgezeichnet (wodurch der anfängliche pH-Wert gesenkt wurde). Flüssigkeit auf 4,4 bzw. 4,3), ohne den Erfassungsbereich zu spülen (Abb. 3f). Dieser Test zeigte die Empfindlichkeit des Sensors bei der Erkennung kleiner (0,1) pH-Änderungen in der Lösung. Untere Grenzwerte sollten mit einem Messaufbau mit Sub-nA-Stromauflösung weiter untersucht werden, der derzeit für unsere tragbare Lösung nicht verfügbar ist.

Als Proof-of-Concept des Sensors verwenden wir aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) gewonnene kortikale Neuronen und zeigen die Fähigkeit des Sensors, ihre Aktionspotentialaktivität extrazellulär aufzuzeichnen. Zu diesem Zweck haben wir Picrotoxin, einen nicht-kompetitiven \(GABA_A\)-Antagonisten, eingeführt und verwendet, um in unserer Zellkultur ein Burst-ähnliches Verhalten zu induzieren, das mit dem MEA-Chip nachgewiesen werden kann. Vor der Aufzeichnung der extrazellulären Spike-Aktivität wurde die Biokompatibilität des Chips getestet. Neurale Vorläuferzellen (NPCs) wurden 7 Tage lang differenziert und reiften 2 Wochen lang auf dem Chip, bevor die Zellen fixiert und gefärbt wurden. Die Färbung zeigte reife Neuronenmarker (\(\beta 3\) Tubulin/grün) sowie die Produktion synaptischer Vesikel (Synaptophysin/rot). Die erfolgreiche Reifung der von hiPSC abgeleiteten kortikalen Neuronen bestätigte die Biokompatibilität der Chips für Live- und nicht-invasive Messungen (Abb. 4a, b).

Für die Aufzeichnung der extrazellulären Spike-Aktivität verwendeten wir den Ausleseaufbau von Multichannel Systems (MCS), einem kommerziell erhältlichen und häufig verwendeten System für elektrophysiologische Messungen in Labors (Abb. 4c). Der Grund bestand darin, die Kompatibilität mit einem standardisierten Auslesesystem und die Fähigkeit unseres Chips zu demonstrieren, in jedem Labor mit dieser Ausrüstung verwendet zu werden, ohne dass zusätzliche Hintergrundkenntnisse des Endbenutzers erforderlich sind. Wir haben eine Leiterplatte entworfen, die mit dem MCS-Ausleseaufbau für das 60-Elektroden-MEA-Modell kompatibel war. Durch den Einbau einer Öffnung in der Mitte der Leiterplatte haben Endbenutzer dank der transparenten PDMS-Membran Einblick in die Zellkultur (Abb. 4d).

Als Proof-of-Concept haben wir spontane elektrophysiologische Signale von hiPSC-abgeleiteten kortikalen Neuronen von einer Mikroelektrode aufgezeichnet. Aus der Nachbearbeitung des aufgezeichneten Signals ergab sich eine durchschnittliche Feuerrate von 0,9661 Hz. Der Zellkultur wurde Picrotoxin zugesetzt, um einen epilepsieähnlichen Zustand in der Zellkultur hervorzurufen34 und um festzustellen, ob der Chip Veränderungen im elektrophysiologischen Signal der Neuronen messen kann. Wir haben das Picrotoxin (50 \(\upmu \hbox {M}\)) 20 s nach Beginn der Aufnahmen eingeführt, wie in Abb. 4e – blaue Linie – zu sehen ist. Abb. 4f zeigt einen repräsentativen Kanal, der aufgezeichnet wurde, und es zeigte sich, dass die Feuerrate im Durchschnitt (N = 3) von 0,31 ± 0,1 Hz vor der Zugabe des Picrotoxins auf 1,38 ± 0,25 Hz nach der Zugabe des Arzneimittels anstieg. Die daraus resultierende Signalproduktion der hiPSC-abgeleiteten Neuronen, die in Abb. 4f mit einem Burst-ähnlichen Ereignis (Einfügung „nach Picrotoxin“) zu sehen ist, ist repräsentativ für die Exposition gegenüber Picrotoxin.

Biokompatibilität und elektrophysiologische Proof-of-Concept-Experimente: (a, b) HiPSC-abgeleitete kortikale Neuronen differenzierten (7 Tage) und reiften (14 Tage) auf dem Chip. Nach der Färbung sind \(\beta 3\) Tubulin-positive Neuronen (grün) und synaptische Vesikel (rot) sichtbar. (c) Kompatibilität mit Multichannel Systems MEA-Aufzeichnungsaufbau der Leiterplatte und des Chips. (d) Einschub, der den Chip und die Vertiefung mit Medium und Zellen zeigt. (e) Einzelelektroden-Spurensignal aus den MEA-Aufzeichnungen. (f) Die Zugabe von Picrotoxin (50 \(\upmu \hbox {M}\)) führte zu einer Erhöhung der Feuerrate.

Wir haben die Fähigkeit des FG-FET-basierten Sensors gezeigt, lokale Änderungen des pH-Werts und extrazelluläre Aktionspotentialaufzeichnungen auf dem Chip zu messen.

Unser pH-Sensor zeigte eine Wiederholbarkeit der Messung bei fortlaufendem Wechsel der zu testenden Flüssigkeit, ohne dass die Sensorelektroden bei stundenlangen Messperioden gesättigt wurden. Aufgrund der ausgeprägten Ablaufstrom-Fingerabdrücke ist eine Bestimmung des pH-Wertes der Flüssigkeiten möglich (Abb. 3d). Abhängig von der Breite und Länge der Kanäle der FETs wurden unterschiedliche Anfangswerte der Schwellenspannung erhalten. Der Unterschied in den anfänglichen Drainstromwerten wird durch unterschiedliche Gate-Abmessungen und mögliche Fehler verursacht, die während der Herstellung auftreten können. Um den Fingerabdruck des Sensors zu erhalten, wäre eine Kalibrierung jedes FET mit pH-Pufferflüssigkeiten erforderlich, bevor Flüssigkeiten in physiologisch relevanten Umgebungen getestet werden. Für die Experimente wurden nach der Messung des anfänglichen Arbeitspunkts des FET die Werte der pH-Änderungen überwacht. Gleichzeitige Messungen an mehreren Elektroden gleichzeitig können zu Übersprechen zwischen den Elektroden und zusätzlichem Rauschen führen, wodurch sich das Signal-Rausch-Verhältnis verschlechtert. Während der Herstellung des Geräts könnte eine elektrische Schutzring-Isolierschicht35 hinzugefügt werden, um sicherzustellen, dass mögliches Übersprechen zwischen nahegelegenen Zellumgebungen vermieden wird.

Ladungsmodulierte FG-FETs sind vielversprechend, auch wenn die im FG eingefangenen Ladungen sehr klein sind und ohne Verwendung einer Referenzelektrode (oder Pseudoelektrode) manipuliert werden können. Bei Bedarf würde das Anlegen einer Spannung direkt an den FG vor Experimenten die darin eingefangenen Ladungen erhöhen und somit zu einer größeren Änderung der Schwellenspannung führen. Beim Vergleich unseres Silizium-Polymer-Hybridsensors mit dem Stand der Technik7,12 verwenden wir niedrigere Spannungswerte und erhalten höhere Stromänderungen (\(\upmu \hbox {A}\) statt nA), was die Lebensfähigkeit der Zelle erhöhen könnte Kulturen, bei denen lange Kultivierungszeiten erforderlich sind, um verschiedene zu testende Phänotypen zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht der Reinraumfertigungsprozess im Wafer-Maßstab eine höhere Präzision, Reproduzierbarkeit und Ausbeute der Sensoren und ermöglicht bei Bedarf die Integration mehrerer Materialien und komplexerer Schaltkreise in OoC-Geräte. Bei unserem Gerät sind der Erfassungsbereich und die elektronischen Anschlüsse voneinander isoliert. Daher können selektive Beschichtungen als Nachbearbeitungsschritt aufgebracht werden, ohne die intrinsischen Materialien (z. B. Gate-Oxid) der Transistoren zu ändern36. Durch diesen Nachbearbeitungsschritt können unterschiedliche Ladungs- oder Affinitätssensoren realisiert werden.

Als Proof-of-Concept haben wir hier eine geringe Anzahl von Aufzeichnungselektroden verwendet. Aufgrund der Reinraumverarbeitungsfähigkeiten kann die Anzahl der Mikroelektroden jedoch erhöht werden, ohne die kleine Fläche des Chips (1 \(\hbox {cm}^2\)) zu beeinträchtigen. Das Rauschen, das mit den Aufzeichnungen des extrazellulären Aktionspotentials gekoppelt werden kann, ist größtenteils thermischer Natur15.

Die Aktivität neuronaler Netzwerke kann mit unterschiedlichen Frequenzen aufgezeichnet werden, je nachdem, welche Informationen untersucht werden sollen. Für den pH-Sensor wurde eine Abtastrate von 1 Hz gewählt. Obwohl Aktionspotentialereignisse normalerweise bei höheren Frequenzen auftreten, kann der gleiche Aufbau ohne Modifikationen auch für die Elektrophysiologie verwendet werden. Die spontane elektrophysiologische Aktivität der hiPSC-abgeleiteten kortikalen Neuronen wurde erfolgreich auf dem Chip gemessen und je nach Bedarf ist es auch möglich, lokale Feldpotentiale aufzuzeichnen. Da die für diese Studie verwendeten Elektroden im Vergleich zur typischen Zellgröße relativ groß sind (verschiedene Größen, bis zu 100 \(\upmu \hbox {m}\)), könnten sie gute Kandidaten für niederfrequente Lokalfeld-Elektroden sein. mögliche Aufnahmen. Aufgrund des \(1/f^2\)-Rauschens sind größere Elektroden günstiger15. Darüber hinaus können die Potenzialunterschiede an den Anschlüssen \(CG_2\) und FG das elektrische Feld verstärken und könnten zur Untersuchung des gerichteten Neuritenwachstums37 und möglicherweise sogar zur Bestimmung der Wachstumsrichtung der Axone verwendet werden. Galvanotropismusstudien haben gezeigt, dass es möglich ist, das Wachstum von Axonen abhängig von der Feldstärke zu steuern. Dies könnte ein natürlicherer Ansatz sein, im Gegensatz zur Verwendung topografischer Hinweise wie Rillen, um Axone so zu steuern, dass sie beispielsweise die räumliche Organisation nachahmen, wie sie im Kortex von Brain-on-Chip-Modellen zu sehen ist38,39,40.

Obwohl wir das Funktionsprinzip des Geräts für die beiden Erfassungsmodi, nämlich die Verfolgung des Drainstroms der FETs zur Unterscheidung von Flüssigkeiten mit unterschiedlichen pH-Werten und die Aufzeichnung des extrazellulären Aktionspotentials, getrennt gezeigt haben, können die Messungen in Zukunft gleichzeitig durchgeführt werden auf demselben Chip, um sowohl die elektrische Aktivität als auch pH-Änderungen unter physiologisch relevanten Bedingungen zu überwachen. Die Bimodalität des integrierten Sensors würde gleichzeitige Messungen der Änderung der Ladungskonzentration in den Medien und externer Aktionspotentiale der Zellen ermöglichen, was relevante Informationen über bestimmte Krankheitsphänotypen und die Lebensfähigkeit von Zellen liefern könnte, ohne dass die Medien zur Analyse übertragen werden müssten auf ein anderes Modul. Echtzeitmessungen der pH-Änderung tatsächlicher Zellmedien im Laufe der Zeit sind ebenfalls Teil zukünftiger Arbeiten. Schließlich kann der Chip aufgrund seiner Kompaktheit und der Verwendung des mobilen Messaufbaus problemlos in OoC-Plattformen integriert werden, beispielsweise in die Translational Organ-on-Chip (TOP)-Plattform41. Dies würde die Untersuchung mehrerer Organmodule und die Überwachung mehrerer biologischer Hinweise mit der Mikrofluidikplatine erleichtern, die für verschiedene Gradienten42 modelliert und für Flüssigkeitsmanipulation und biochemische Tests43 programmiert werden kann.

Das Gerät wird mithilfe eines CMOS-kompatiblen Prozessablaufs auf Waferebene hergestellt. Für die Herstellung von nMOS-basierten Sensoren unter Verwendung eines Standard-BiCMOS-Prozesses wurde ein 4 Zoll großer, 525 µm dicker, doppelseitig polierter Si-Wafer vom p-Typ verwendet. Nach der Definition von Source- und Drain-Anschlüssen durch Ionenimplantation wurde eine 100 nm dicke Gate-Oxidschicht thermisch aufgewachsen. Eine 6 μm dicke Oxidschicht wurde durch plasmaunterstützte chemische Gasphasenabscheidung (PECVD) abgeschieden und auf der Waferrückseite als Ätzhartmaske strukturiert (Abb. 2a, 1). Eine 1 \(\upmu \hbox {m}\)-dicke Schicht aus \(Al/1\%\)Si wurde auf der Vorderseite gesputtert und strukturiert, um elektrische Verbindungen und Floating Gates zu implementieren (Abb. 2a,2). Als Dielektrikum zwischen CG- und FG-Elektroden wurde eine 150 nm dicke PECVD-Oxidschicht verwendet. Anschließend wurde Polyimid (PI, Fujifilm LTC9305, Europe NV, Belgien) aufgeschleudert und als isolierende und mechanische Übergangsschicht strukturiert, um den größten Teil der Ausdehnung des Floating Gate auf den OoC-Erfassungsbereich abzudecken (Abb. 2a, 3). Eine gesputterte 300 nm dicke Ti-Schicht wurde strukturiert, um als CGs und FG-Erweiterungen sowie als Mikroelektroden für die Aufzeichnung des Aktionspotentials zu dienen (Abb. 2a, 4). Polydimethylsiloxan (PDMS, Sylgrad 184, Dow Corning, Midland, MI, USA) wurde mit seinem Härter im Verhältnis 10:1 gemischt, entgast, schleuderbeschichtet und gehärtet, um als 20 µm dicke Membran zu dienen für den Bereich OoC-Zellkultivierung/Ladungsmessung. Als Schutzschicht auf der PDMS-Membran wurde ein 200 nm dickes AlSi aufgesputtert, das später durch Ätzen des Si-Substrats von der Rückseite durch tiefes reaktives Ionenätzen freigesetzt wurde (Abb. 2a, 5). Der Wafer wurde schließlich in 52 gleiche, quadratische Chips mit einer Grundfläche von 1 \(\hbox {cm}^2\) gewürfelt. Anschließend wurde ein 3D-gedruckter Halter (MOIIN Tech Clear Resin, Hamburg, Deutschland) montiert und die Chips per Drahtbondung auf maßgeschneiderte Leiterplatten geklebt. Abhängig vom elektrischen Kontaktanschluss am Gerät können die Sensoren als FET-basierter Ladungssensor oder Mikroelektrode verwendet werden, um Aktionspotentialereignisse von elektrisch aktiven Zellen zu erfassen. Zuletzt wurden 3D-gedruckte Vertiefungen (Durchmesser = 6 mm, Höhe = 7 mm) (MOIIN Tech Clear Resin) mit PDMS auf den Sensorbereich geklebt, um die Handhabung von Flüssigkeiten zu erleichtern (Abb. 2b).

Zur Analyse des FG-FET wird das zugrunde liegende Gleichungssystem in Matlab gelöst. Diese Gleichungen lösen nach dem Potential am Floating-Gate \(V_{FG}\), dem Potential an der Sensoroberfläche \(\Psi _S\) und EDL \(\Psi _{A}\) und den entsprechenden Oberflächenladungen \( \sigma_S\) und \(\sigma_{A}\)12.

Das Potenzial an der Doppelschicht beeinflusst die Oberflächenladung \(\Psi _S\) und korreliert mit dem Volumenpotential der Lösung (\(V_{B ulk}\), von dem angenommen wird, dass es mit der von \(CG_2\) angelegten Spannung übereinstimmt. ) zu der Oberfläche. Zusätzlich verändert \(CG_2\) das Potenzial am EDL oben auf der Sensoroberfläche:

Die Kapazität aufgrund von \(CG_2\) wurde berechnet, indem eine weitere Stern-Schicht aufgrund der Elektrolyt-Elektroden-Grenzfläche und ihrer nativen TiO2-Schicht angenommen wurde. Die Oberflächenladung aufgrund von Hydroxylgruppen an der Oxidoberfläche hängt von der Anzahl der Bindungsstellen \(N_s\) und den Oberflächendissoziationskonstanten \(K_*\) ab:

Die Änderung der Schwellenspannung ergibt sich aus der Nettoladung an der Sensoroberfläche (\(Q_S\)) und der anfänglichen Schwellenspannung, die aus dem CG erhalten wird:

Dieses Gleichungssystem wurde verwendet, um das Verhalten des FG-FET-basierten Sensors für verschiedene pH- und Dissoziationskonstantenwerte zu berechnen.

Für die pH-Messung wurde ein mobiler Messaufbau entwickelt (Abb. 3c). Das Gerät verfügt über eine Sensorplatine, um den Floating-Gate-FET vorzuspannen und das Ausgangsstromsignal in Spannung umzuwandeln (eingestellt über schaltbare Widerstände, um sogar im nA-Bereich zu erfassen). Darüber hinaus wurde ein 18-Bit-Analog-Digital-Wandler (ADC) zur Umwandlung der Spannungswerte in einen digitalen Code eingesetzt und die Übertragung des Signals erfolgte über Bluetooth Low Energy. Das Ausgangssignal wurde von einem MATLAB-Skript sowie einem Android-Gerät überwacht.

Die hiPSC-Linie LUMC0114iCTRL01 (hPSCreg-Nummer LUMCi003-A)44 wurde zur Ableitung neuronaler Vorläuferzellen (NPCs) unter Verwendung des STEMdiff SMADi Neural Induction Kit (05835, StemCell Technologies) verwendet. Der Chip wurde vor der Beschichtung mit Poly-L-Ornithin (P3655, Sigma Aldrich) mit einer Konzentration von 100 \(\upmu) plasmabehandelt (50 W, 50 KHz, 45 s mit dem CUTE Plasma System von Femto Science, Selangor, Malaysia). \)g/ml und über Nacht bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Am nächsten Tag wurde der Chip 30 Minuten lang bei \(4\,\,^{\circ }\hbox {C}\) inkubiert, bevor eine Lamininbeschichtung (\(200\,\frac{\upmu \hbox {g}) }{\hbox {mL}}\)) angewendet wurde. Danach wurde der Chip 2 Stunden lang bei \(37\,\,^{\circ }\hbox{C}\) inkubiert. NPCs wurden in einer Konzentration von 100.000 Zellen \(\cdot \hbox {cm}^{-2}\) auf dem Chip ausgesät und anschließend 7 Tage lang mit dem STEMdiff Midbrain Neuron Differentiation Kit (100-0038, Stammzelltechnologien). Schließlich wurden die von hiPSC abgeleiteten kortikalen Neuronen gereift und für den Rest des Experiments in BrainPhys hiPSC Neuron Kit-Medien (05795, StemCell Technologies) aufbewahrt. Alle Medien wurden mit (1 %) Penicillin/Streptovidin ergänzt. Für die Arzneimittelexperimente wurde zur Blockierung der Hemmung Picrotoxin (P1675-1G, Sigma Aldrich) in einer Konzentration von 50 \(\upmu \hbox {M}\) in BrainPhys-Medium vorbereitet und 20 Sekunden nach Beginn der Aufzeichnungen hinzugefügt.

Das MEA2100-System (Multi Channel Systems, Reutlingen, Deutschland) wurde verwendet, um die elektrophysiologische Aktivität der Neuronen auf dem Chip aufzuzeichnen, wobei die Heizstufe auf \(37\,\,^{\circ }\hbox{C}\) eingestellt war. Mehrere Aufzeichnungen von 1 Minute bei 10 kHz wurden an Tagen in vitro (DIV) 21 (dh 7 Tage Differenzierung und 14 Tage Reifung) aufgenommen. Die Daten wurden mit einem Butterworth-Hochpassfilter mit einer Grenzfrequenz von 200 Hz erfasst. Rohaufzeichnungsdateien (.msrd) wurden vom MEA2100-System bezogen und mit der MCS-Software in HDF5-Dateien konvertiert. Wir haben MEA-ToolBox45 verwendet, um die MEA-Daten in MATLAB 2018b (Mathworks, Massachusetts, USA) zu analysieren. MEA-ToolBox wurde auf den Schwellenwert \(5 \cdot RMS\) für die Spitzenerkennung eingestellt und der Mittelwert wurde aus 3 Aufzeichnungen berechnet.

Die von hiPSC abgeleiteten kortikalen Neuronen wurden bei DIV 21 in (4 %) Paraformaldehyd für 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) fixiert und mit (1 %) Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Sigma-Aldrich) für 20 Minuten. Nach dem Permeabilisierungsschritt wurden die Zellen dreimal für jeweils 5 Minuten bei RT in PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann 30 Minuten lang mit (1 %) Rinderserumalbumin (BSA; Nr. 9048468, SigmaAldrich) inkubiert, um unspezifische Bindung zu blockieren, und erneut dreimal jeweils 5 Minuten lang bei RT in PBS gewaschen. Die verwendeten Primärantikörper waren \(\beta 3\) Tubulin (polyklonales Kaninchen PA5-86069, Thermofisher, Waltham, MA, USA) und Synaptophysin (monoklonales Maus-ab8049, Abcam, Cambridge, UK). Diese primären Antikörper wurden 1:200 in \(1 \%\) BSA in dPBS (enthält kein Magnesium und Calcium) verdünnt und 1 Stunde bei RT inkubiert. Die sekundären Antikörper waren Texas Red (Ziege Anti-Maus, ab7066, Abcam) und Alexa Fluor® 488 nm (Ziege Anti-Kaninchen, ab150077, Abcam), die 1:500 in \(1 \%\) BSA in dPBS verdünnt wurden. Diese Sekundärantikörper wurden 1 Stunde lang bei RT im Dunkeln inkubiert und anschließend dreimal jeweils 5 Minuten lang mit PBS gewaschen. Zellkerne wurden 20 Minuten lang mit NucBlue (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) gefärbt. Fluoreszenzbilder wurden mit einem Keyence BZ-810-Mikroskopsystem (Osaka, Japan) aufgenommen.

Die während der aktuellen Studie generierten Datensätze sind beim entsprechenden Autor erhältlich. Analysierte Datensätze sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

Marx, U. et al. Von der Biologie inspirierte mikrophysiologische Systemansätze zur Lösung des Vorhersagedilemmas der Substanzprüfung. ALTEX 33, 272–321 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Preetam, S. et al. Entstehung der Mikrofluidik für biomedizinische Geräte der nächsten Generation. Biosens. Bioelektron. X, 100106 (2022).

Google Scholar

Bendre, A. et al. Aktuelle Entwicklungen in der Mikrofluidik-Technologie zur Synthese und Toxizitäts-Effizienz-Studien biomedizinischer Nanomaterialien. Mater. Heute Adv. 13, 100205 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Bhat, MP et al. Jüngste Fortschritte bei der mikrofluidischen Plattform zur physikalischen und immunologischen Erkennung und Erfassung zirkulierender Tumorzellen. Biosensoren 12, 220 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mastrangeli, M. & van den Eijnden-van Raaij, J. Organs-on-chip: Der Weg nach vorne. Stimmzellenvertreter. 16, 2037–2043 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Zhang, YS et al. Multisensor-integrierte Organs-on-Chips-Plattform für die automatisierte und kontinuierliche In-situ-Überwachung organoider Verhaltensweisen. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. 114, E2293–E2302 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Spanu, A. et al. Ein referenzloser pH-Sensor basierend auf einem organischen Feldeffekttransistor mit einstellbarer Empfindlichkeit. Org. Elektron. 48, 188–193 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Bousse, L., De Rooij, NF & Bergveld, P. Betrieb chemisch empfindlicher Feldeffektsensoren als Funktion der Isolator-Elektrolyt-Grenzfläche. IEEE Trans. Electron Devices 30, 1263–1270 (1983).

Artikel ADS Google Scholar

Demelas, M. et al. Ladungserfassung durch organische ladungsmodulierte Feldeffekttransistoren: Anwendung zur Erkennung biobedingter Effekte. J. Mater. Chem. B 1, 3811–3819 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chen, B., Parashar, A. & Pandey, S. Gefalteter Floating-Gate-CMOS-Biosensor zur Erkennung geladener biochemischer Moleküle. IEEE Sens. J. 11, 2906–2910 (2011).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Barbaro, M., Bonfiglio, A. & Raffo, L. Ein ladungsmodulierter Fet zur Erkennung biomolekularer Prozesse: Konzeption, Modellierung und Simulation. IEEE Trans. Electron Devices 53, 158–166 (2005).

Artikel ADS Google Scholar

Spanu, A. et al. Ein auf organischen Transistoren basierendes System zur referenzlosen elektrophysiologischen Überwachung erregbarer Zellen. Wissenschaft. Rep. 5, 1–7 (2015).

Artikel Google Scholar

Thomas, MS, White, SP, Dorfman, KD & Frisbie, CD Grenzflächenladungsbeiträge zur chemischen Sensorik durch elektrolytgesteuerte Transistoren mit schwebenden Gates. J. Phys. Chem. Lette. 9, 1335–1339 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Spanu, A. Organische Transistorgeräte für elektrophysiologische In-vitro-Anwendungen (Springer, 2016).

Obien, MEJ, Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, DJ & Frey, U. Aufdeckung neuronaler Funktionen durch Mikroelektroden-Array-Aufzeichnungen. Vorderseite. Neurosci. 8, 423 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Mossink, B. et al. Menschliche neuronale Netzwerke auf Mikroelektrodenarrays sind ein äußerst robustes Werkzeug zur Untersuchung krankheitsspezifischer Genotyp-Phänotyp-Korrelationen in vitro. Stem Cell Rep. 16, 2182–2196 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Cao, Z. et al. Clustered Burst Firing in Hippocampus-Neuronen mit fmr1-Prämutation: Verbesserung mit Allopregnanolon. Summen. Mol. Genet. 21, 2923–2935 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bateup, HS et al. Erregendes/hemmendes synaptisches Ungleichgewicht führt in Mausmodellen für tuberöse Sklerose zu einer Übererregbarkeit des Hippocampus. Neuron 78, 510–522 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wainger, BJ et al. Intrinsische Membranübererregbarkeit von Motoneuronen, die von Patienten mit amyotropher Lateralsklerose stammen. Cell Rep. 7, 1–11 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bradley, JA, Luithardt, HH, Metea, MR & Strock, CJ In-vitro-Screening auf Anfallsgefahr mithilfe der Mikroelektroden-Array-Technologie. Toxicol. Wissenschaft. 163, 240–253 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Buzsaki, G. & Draguhn, A. Neuronale Schwingungen in kortikalen Netzwerken. Wissenschaft 304, 1926–1929 (2004).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Charkhkar, H. et al. Neuartiges Einweg-Mikroelektroden-Array für die Aufzeichnung kultivierter neuronaler Netzwerke, das eine gleichwertige Leistung wie kommerziell erhältliche Arrays aufweist. Sens. Aktoren B Chem. 226, 232–238 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Shin, H. et al. 3D-Mikroelektroden-Array mit hoher Dichte mit optischer Stimulation und Medikamentenabgabe zur Untersuchung der Dynamik neuronaler Schaltkreise. Nat. Komm. 12, 1–18 (2021).

Artikel ADS Google Scholar

Zitzmann, FD et al. Ein neuartiger mikrofluidischer Mikroelektrodenchip für eine deutlich verbesserte Überwachung der NPY-Rezeptoraktivierung im Live-Modus. Lab Chip 17, 4294–4302 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Aydogmus, H. et al. Fet-basierter integrierter Ladungssensor für Organ-on-Chip-Anwendungen, im Jahr 2020 IEEE Sensors, 1–4 (IEEE, 2020).

Odijk, M. et al. Mikrogefertigte ionenselektive Festkörperelektrodensonde zur Messung von Kalium im Gehirn lebender Nagetiere: Kompatibilität mit DC-EEG-Aufzeichnungen zur Untersuchung der Ausbreitungsdepression. Sens. Aktoren B Chem. 207, 945–953 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Müller, B. et al. Messung der Atmungs- und Ansäuerungsraten von Säugetierzellen in thermoplastischen Mikrofluidikgeräten. Sens. Aktoren B Chem. 334, 129664 (2021).

Artikel Google Scholar

Kaisti, M. et al. Ein ionenempfindliches Floating-Gate-FET-Modell: Funktionsprinzipien und elektrofluidisches Gating. IEEE Trans. Electron Devices 62, 2628–2635 (2015).

Artikel ADS Google Scholar

Van Hal, R., Eijkel, J. & Bergveld, P. Ein allgemeines Modell zur Beschreibung des elektrostatischen Potentials an Elektrolytoxidgrenzflächen. Adv. Kolloidschnittstellenwissenschaft. 69, 31–62 (1996).

Artikel Google Scholar

Kaisti, M., Zhang, Q. & Levon, K. Kompaktes Modell und Designüberlegungen eines ionenempfindlichen Floating-Gate-FET. Sens. Aktoren B Chem. 241, 321–326 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Shibata, T. & Ohmi, T. Ein funktionaler MOS-Transistor mit gewichteten Summen- und Schwellenwertoperationen auf Gate-Ebene. IEEE Trans. Electron Devices 39, 1444–1455 (1992).

Artikel ADS Google Scholar

Manjakkal, L., Szwagierczak, D. & Dahiya, R. Auf Metalloxiden basierende elektrochemische pH-Sensoren: Aktuelle Fortschritte und Zukunftsperspektiven. Fortschritt Mater. Wissenschaft. 109, 100635 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Lin, S.-H., Chiou, C.-H., Chang, C.-K. & Juang, R.-S. Photokatalytischer Abbau von Phenol auf verschiedenen Phasen von Tio2-Partikeln in wässrigen Suspensionen unter UV-Bestrahlung. J. Umgebung. Geschäftsführer 92, 3098–3104 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Rho, JM, Donevan, SD & Rogawski, MA Direkte Aktivierung von Gabaa-Rezeptoren durch Barbiturate in kultivierten Hippocampusneuronen der Ratte. J. Physiol. 497, 509–522 (1996).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Neamen, DA Halbleiterphysik und -geräte: Grundprinzipien (McGraw-hill, 2003).

Avdogmus, H. et al. Dual-Gate-Ladungssensor auf Fet-Basis, verbessert durch In-situ-Elektrodendekoration in einer Mems-Organs-on-Chip-Plattform, im Jahr 2021, 21. Internationale Konferenz über Festkörpersensoren, Aktoren und Mikrosysteme (Wandler), 180–183 (IEEE, 2021 ).

Deumens, R. et al. Die Ausrichtung von Gliazellen stimuliert in vitro das gerichtete Neuritenwachstum von ZNS-Neuronen. Neurowissenschaften 125, 591–604 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gokoffski, KK, Jia, X., Shvarts, D., Xia, G. & Zhao, M. Physiologische elektrische Felder steuern das Axonwachstum retinaler Ganglienzellen in vitro. Investig. Ophthalmol. Vis. Wissenschaft. 60, 3659–3668 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Yamashita, M. Schwache elektrische Felder dienen als Orientierungshilfen, die die Axone retinaler Ganglienzellen in vitro steuern. Biochem. Biophys. Rep. 4, 83–88 (2015).

PubMed PubMed Central Google Scholar

McCaig, CD, Rajnicek, AM, Song, B. & Zhao, M. Zellverhalten elektrisch steuern: Aktuelle Ansichten und zukünftiges Potenzial. Physiol. Rev. (2005).

Vollertsen, AR et al. Erleichterung der Implementierung von Organs-on-Chips durch offene Plattformtechnologie. Biomicrofluidics 15, 051301 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Micheli, S., Mocellin, P., Sorgato, M., Bova, L. & Cimetta, E. Modellierungsbasierte Designspezifikationen für mikrofluidische Gradientengeneratoren für biomedizinische Anwendungen. Biochem. Ing. J. 181, 108415 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Zhang, D., Li, W., Shang, Y. & Shang, L. Programmierbare mikrofluidische Manipulationen für biomedizinische Anwendungen. Ing. Regen. (2022).

Buijsen, RA et al. Erzeugung von 3 vom Patienten stammenden induzierten pluripotenten Stammzelllinien lumci002-a, b und c mit spinozerebellärer Ataxie Typ 1 (sca1) und 2 nicht betroffenen Geschwisterkontroll-induzierten pluripotenten Stammzelllinien lumci003-a und b. Stammzellres. 29, 125–128 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hu, M. et al. Mea-Toolbox: Eine Open-Source-Toolbox für die standardisierte Analyse von Multi-Elektroden-Array-Daten. Neuroinformatik 1–16 (2022).

Referenzen herunterladen

Die Autoren danken den Mitarbeitern des Else Kooi-Labors der TU Delft für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Niederländischen Organ-on-Chip-Initiative unterstützt, einem NWO-Gravitationsprojekt, das vom Ministerium für Bildung, Kultur und Wissenschaft der niederländischen Regierung finanziert wird (024.003.001).

ECTM, Abteilung für Mikroelektronik, Technische Universität Delft, Delft, 2628 CD, Niederlande

Hande Aydogmus, Lovro Ivancevic, Pasqualina M. Sarro und Massimo Mastrangeli

Abteilung für Humangenetik, Medizinisches Zentrum der Universität Leiden, 2333 ZC, Leiden, Niederlande

Michel Hu, Jean-Philippe Frimat und Arn MJM van den Maagdenberg

Abteilung für Neurologie, Medizinisches Zentrum der Universität Leiden, 2333 ZC, Leiden, Niederlande

Michel Hu, Jean-Philippe Frimat und Arn MJM van den Maagdenberg

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MM und HA haben die Forschung vorgeschlagen und entworfen und das Manuskript geschrieben. LI hat das mobile Messsystem entwickelt. HA stellte das Gerät her und führte elektrische Charakterisierungen durch. JPF und MH führten alle Zellkulturexperimente durch und zeichneten die MEA-Daten auf und analysierten sie. JPF und MH trugen auch zum Schreiben für die Elektrophysiologie-Sektion bei und kommentierten das Manuskript. AMJMvdM, PMS und MM kommentierten das Manuskript und lieferten zusätzliche Erkenntnisse. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Hande Aydogmus.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Aydogmus, H., Hu, M., Ivancevic, L. et al. Ein Organ-on-Chip-Gerät mit integrierten Ladungssensoren und aufzeichnenden Mikroelektroden. Sci Rep 13, 8062 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34786-5

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Eingegangen: 04. August 2022

Angenommen: 08. Mai 2023

Veröffentlicht: 18. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34786-5

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