Biokompatibilität von neuartigem Albumin

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 12749 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Viele medizinische Verfahren könnten von der Verwendung von Gewebeversiegelungen profitieren, die eine kürzere Operationszeit, einen begrenzten Blutverlust, eine einfachere Gewebehandhabung und weniger postoperative Komplikationen ermöglichen. Die Sicherheit und Biokompatibilität chirurgischer Versiegelungen ist von größter Bedeutung. Ziel dieser Studie ist es daher, die Biokompatibilität des chirurgischen Klebstoffs NE'X Glue zu untersuchen. Chemische Charakterisierung (VOC und Elemente), Zytotoxizität (MEM-Elution), Genotoxizität (AMES und MLA), Endotoxinkontamination, Sensibilisierungspotenzial, intrakutane Reaktivität, akute und subchronische systemische Toxizität bei Implantation sowie Pyrogenität wurden bewertet, um die Biokompatibilität des NE zu untersuchen 'X Glue Chirurgischer Kleber. Die Studien wurden gemäß den ISO 10993-Standards durchgeführt. Die Biokompatibilitätsanforderungen gemäß ISO 10993-1 für NE'X Glue wurden erfüllt. In-vitro-Studien haben gezeigt, dass der chirurgische Klebstoff NE'X Glue nicht zytotoxisch und nicht mutagen ist. In-vivo-Studien haben außerdem gezeigt, dass NE'X Glue keine Anzeichen von Toxizität zeigt, kein pyrogenes Potenzial aufweist und nicht sensibilisierend und nicht reizend ist. Die chemische Charakterisierung ergab, dass keine Verbindungen über dem analytischen Bewertungsschwellenwert (AET) identifiziert wurden und keine Elemente mit Konzentrationen über der elementspezifischen PDE (µg/Tag) nachgewiesen wurden. NE'X Glue Surgical Adhesive ist ein vielseitiges und vielversprechendes neues chirurgisches Versiegelungsmittel mit einem breiten Anwendungsspektrum und sehr guter Biokompatibilität.

Jedes Jahr werden unzählige medizinische Eingriffe durchgeführt, um den Wundverschluss zu ermöglichen, Blutungen zu stoppen und Undichtigkeiten zu verhindern. Zu den herkömmlichen Methoden zur Erzielung einer Blutstillung gehören die Verwendung von Klammern, Nähten, Klammern und Elektrokoagulation. Obwohl diese Methoden für die meisten Verfahren gut funktionieren, sind sie bei anspruchsvolleren Anwendungen nicht so gut1. Am häufigsten werden Nähte verwendet, die jedoch auch durch viele Nachteile gekennzeichnet sind. Ihre Platzierung kann schwierig und zeitaufwändig sein, führt zu Schäden und die immunologische Reaktion des Gewebes erhöht das Risiko einer mikrobiellen Infektion. Daher könnten viele medizinische Verfahren von der Verwendung von Gewebeversiegelungen profitieren, die eine kürzere Operationszeit, einen begrenzten Blutverlust, eine einfachere Gewebehandhabung und weniger postoperative Komplikationen ermöglichen. Darüber hinaus verringert oder eliminiert der Einsatz von Klebstoffen die lokale Belastungsspannung zwischen gebrochenen Oberflächen2,3. Chirurgische Klebstoffe entwickeln sich in der klinischen Praxis als Ergänzung zu Standardmethoden zur Hämostase zur Verhinderung von Luft- und Flüssigkeitslecks bei Operationen zum Goldstandard. Die physikalischen Eigenschaften und die Haftfestigkeit des Dichtmittels zum Abdichten des Wundbereichs ohne Einschränkung der Gewebefunktion und -bewegung sind Schlüsselfaktoren für seine erfolgreiche Umsetzung in der klinischen Praxis. Im Idealfall sollten chirurgische Versiegelungen biologisch abbaubar sein, ohne eine Entzündungsreaktion hervorzurufen, in einer feuchten Umgebung gut polymerisieren, eine zufriedenstellende Klebekraft besitzen und die Biokompatibilitätsanforderungen ohne oder mit minimaler Gewebetoxizität erfüllen4,5,6.

Gemäß der Definition in ISO 10993-1 ist Biokompatibilität die Fähigkeit eines medizinischen Geräts oder Materials, bei einer bestimmten Anwendung eine entsprechende Reaktion des Wirts auszulösen7. Das ultimative Ziel der Biokompatibilitätsprüfung besteht darin, die mit Medizinprodukten verbundenen Risiken innerhalb der durch die einschlägige Gesetzgebung festgelegten Grenzen zu reduzieren. Die Ergebnisse der Biokompatibilitätsprüfung eines Produkts können jedoch an beiden Enden des zulässigen Spektrums liegen. Der Grad der Biokompatibilität korreliert mit dem Risiko des klinischen Einsatzes des Medizinprodukts, d. h. das Risiko des Auftretens von Nebenwirkungen ist umgekehrt proportional zu den Ergebnissen der Biokompatibilitätstests. Die Verwendung nicht biokompatibler Medizinprodukte kann schwerwiegende gesundheitliche Folgen haben, einschließlich systemischer Toxizität und Tod. Dies ist besonders wichtig bei Medizinprodukten der Klasse III, die mit einem hohen Risiko verbunden sind. Die Sicherheit und Biokompatibilität chirurgischer Versiegelungen sind von größter Bedeutung. Daher wurde in der vorliegenden Studie die Biokompatibilität des chirurgischen Klebstoffs NE'X Glue gemäß ISO 10993 untersucht.

NE'X Glue ist ein zweikomponentiger chirurgischer Klebstoff, der aus gereinigter Albuminlösung und Aldehydlösung besteht und durch Gammabestrahlung sterilisiert wird (Abb. 1). Die Lösungen werden über ein kontrolliertes Abgabesystem und über EO sterilisierte Applikatorspitzen abgegeben. Doppelkammer-Spritzen- und Applikatorspitzen sind so konzipiert, dass sie während der Anwendung ein präzises und reproduzierbares Mischen der Komponenten ermöglichen. Dieser chirurgische Klebstoff beginnt etwa 20 Sekunden lang zu polymerisieren und ist innerhalb von 2 Minuten nach dem Auftragen vollständig polymerisiert. Während des Auftragens von NE'X Glue beginnen sich Aldehydlösung und Albuminlösung in der Applikatorspitze zu vermischen. Bei Kontakt mit dem Gewebe an der Applikationsstelle vernetzt die Aldehydlösung mit der Albuminlösung und den Gewebeproteinen, wodurch eine Versiegelung entsteht. Die Bindung zwischen Aldehyd, Albumin und Gewebeproteinen wird als kovalente Bindung bezeichnet. Während des Polymerisationsprozesses werden Lysinseitenketten von Proteinen mit dem Aldehyd vernetzt (kovalent gebunden).

Foto von NE'X Glue.

Die in dieser Studie verwendeten Methoden wurden bereits ausführlich in unserer vorherigen Veröffentlichung8 beschrieben. Daher wird in den Abschnitten „Material“ und „Methoden“ soweit möglich nur eine kurze Beschreibung gegeben. Detaillierte Informationen finden Sie unter „Ergänzende Materialien“. Zelllinien wurden von ATCC gekauft, Reagenzien für die Zellkultur wurden von Thermo Fisher Scientific, Polen, gekauft und alle chemischen Verbindungen wurden von Sigma, Polen, gekauft, sofern nicht anders angegeben.

Alle Studien wurden gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt, die von der I. Lokalen Ethikkommission in Warschau genehmigt wurden, und unter den Protokollcodes 738/2018, 879/2019 und 864/2019 durchgeführt. Die Versuchsprotokolle wurden sowohl vom I. Lokalen Ethikkomitee für Tierversuche in Warschau als auch vom Europäischen Biomedizinischen Institut genehmigt.

Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die subakute Toxizität in Kombination mit den Implantationsergebnissen wurde mithilfe des zweiseitigen heteroskedastischen T-Tests analysiert. Für alle Auswertungen wurde die GraphPad Prism-Software (Version 9.3.1; GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) verwendet. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die Extraktionsbedingungen wurden basierend auf ISO 10993-12 und der Untersuchung entsprechender ISO-Normen9 ausgewählt. Kurz gesagt, die Extraktionen wurden durch Inkubation des Testmaterials mit einem geeigneten Extraktionsmedium bei 37 ± 1 °C für 72 ± 2 Stunden vorbereitet, sofern nicht anders angegeben. 37 Grad wurden gewählt, da höhere Temperaturen aufgrund des hohen Proteingehalts zu einer Verschlechterung der getesteten Probe führen können. Das Extraktionsvolumen wurde aus Tabelle 1 – Standardoberflächen und Extraktflüssigkeitsvolumina, ISO 10993-12 abgeleitet und mit 0,2 g/ml9 bestimmt. Die Extrakte wurden vor der Dosierung nicht zentrifugiert, filtriert oder anderweitig verändert. Der Extrakt war klar und enthielt keine Partikel. Die Extrakte wurden innerhalb von 24 Stunden nach der Herstellung verwendet.

Gemäß ISO 10993-18 wurde eine semiquantitative VOC-Analyse (flüchtige organische Verbindungen) im NE'X Glue-Wasserextrakt10 durchgeführt. Darüber hinaus wurde eine quantitative Analyse der Elementkonzentration im Wasserextrakt von NE'X Glue durchgeführt.

Unter der Annahme eines Unsicherheitsfaktors von 2, der Verwendung von NE'X-Kleber pro Patient und der Schwelle des toxikologischen Konzerts von 1,5 µg/Tag wurde der AET mit 0,015 µg/ml berechnet.

Weitere Daten finden Sie in den „Ergänzenden Materialien“.

Die Zytotoxizität wurde quantitativ mit der MEM-Elutionsmethode basierend auf ISO 10993-5 und ISO 10993-12 bewertet und wurde bereits beschrieben8,9,11. Kurz gesagt, NE'X-Kleber wurde in MEM mit einfacher Stärke 24 ± 1 Stunde lang bei 37 ± 1 °C mit einem Extraktionsverhältnis von 0,2 g/ml extrahiert. Nach der Extraktion wurden 600 µl Extrakte auf dreifache Einzelschichten von L929-Zellen dosiert und in Gegenwart von 5 ± 0,1 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit 24 ± 1 Stunde lang inkubiert. Als Positivkontrolle wurde DMSO und als Negativkontrolle HDPE-Extrakt verwendet. Anschließend wurden 100 µl frisch zubereitete Färbelösung (Mischung aus Trypanblau-Lösung mit einfach konzentriertem MEM im Verhältnis 1:1) in jede Vertiefung gegeben. Abschließend wurde die Zytotoxizität durch mikroskopische Beobachtungen gemäß Tabelle 1 in ISO 10993-5 bewertet.

Extraktion von NE'X-Kleber für Genotoxizitätsstudien.

Die Menge der extrahierbaren Stoffe wurde durch einen Vorversuch „Bestimmung der extrahierbaren Stoffe“ gemäß ISO 10993-312 ermittelt. Basierend auf den Ergebnissen wurde Methode C – Extraktion gemäß ISO 10993-12 gewählt9. Die Extraktion wurde mit einem geeigneten Extraktionsfahrzeug durchgeführt.

Wie zuvor beschrieben, wurde die Genotoxizität von NE'X Glue auf der Grundlage von ISO 10993-3, ISO 10993-12, ISO 10993-33 und OECD-Test Nr. 490 mithilfe des Mouse Lymphoma Assay9,12,13,14,15 bewertet. Weitere Daten finden Sie in den „Ergänzenden Materialien“.

Die Genotoxizität von NE'X Glue wurde mit dem kommerziell erhältlichen bakteriellen Umkehrmutationstest AMES Penta 2 (Xenometrix) gemäß ISO 10993-3, ISO 10993-12, ISO 10993-33 und OECD-Test Nr. 4719,12,14,16 bewertet . Weitere Daten finden Sie in den „Ergänzenden Materialien“.

Endotoxine wurden mit Pierce Chromogenic Endotoxin Quant K gemessen, was einem Wert von 85 entspricht. Bacterial Endotoxin Test, US Pharmacopoeia17. Der NE'X-Kleber wurde in Wasser zur Injektion mit einem Extraktionsverhältnis von 0,2 g/ml extrahiert. Die Standardkurve wurde gemäß den Herstellerangaben erstellt (R2 = 0,9946). Die interne Validierung des Experiments erfolgte durch Dotierung der Proben mit 0,5 EU/ml Endotoxin. Die nicht dotierten und dotierten Proben wurden untersucht, um die jeweiligen Endotoxinkonzentrationen zu bestimmen. Damit der Test gültig ist, sollte die Differenz zwischen den beiden berechneten Endotoxinwerten der bekannten (0,5 EU/ml) Konzentration der Spitze ± 25 % entsprechen.

Das Sensibilisierungspotenzial des NE'X-Klebers wurde gemäß ISO 10993-10 mit dem Guinea Pig Maximization Test (GPMT)18 analysiert. Kurz gesagt, NE'X Glue wurde mit Natriumchlorid und Baumwollsamenöl extrahiert. Anschließend wurden 30 männliche Meerschweinchen (Dunkin-Hartley) nach dem Zufallsprinzip Studiengruppen (jeweils 10 Tiere) und Lösungsmittelkontrollgruppen (jeweils 5 Tiere) zugeteilt. Vor Versuchsbeginn wurde das Fell durch Abscheren von ca. 50 cm2 am Rücken der Tiere entfernt.

Drei Paare von 0,1 ml intradermalen Injektionen wurden im interskapularen Bereich jedes Tieres auf jeder Seite der Mittellinie (Injektionsstellen A, B, C) durchgeführt. Die Injektionsstellen wurden mit einem permanenten Hautmarker markiert.

6 Tage nach Beginn der Behandlung wurde Natriumdodecylsulfat in Vaseline an der Injektionsstelle B in die Haut einmassiert. 24 Stunden später, 7 Tage nach der ersten intradermalen Induktion, wurden jeweils 0,5 ml des Testprobenextrakts oder der Lösungsmittelkontrolle aufgetragen Tier. Die Applikationsstellen wurden 48 Stunden lang mit Verbänden abgedeckt.

12 Tage nach Abschluss der topischen Induktionsphase wurden 0,5 ml Testprobenextrakte auf die rechte Costa-Region aufgetragen. Geeignete Lösungsmittelkontrollen wurden auf die linke Costa-Region jedes Tieres aufgetragen. Die Applikationsstellen wurden 24 Stunden lang mit Verbänden abgedeckt.

Die zusammengefasste Anwendungsmethodik ist in Tabelle 1 dargestellt.

24 ± 2 und 48 ± 2 Stunden nach dem Entfernen der Pflaster wurden alle behandelten Tiere und Kontrolltiere visuell auf eine Hautreaktion untersucht. Die Intensität von Erythemen und/oder Ödemen wurde anhand der Magnusson- und Kligman-Skala bewertet.

Magnusson- und Kligman-Grade von 1 oder höher in der Testgruppe weisen auf eine Sensibilisierung hin, vorausgesetzt, dass bei Kontrolltieren Grade von weniger als 1 beobachtet werden. Werden bei Kontrolltieren Grade 1 oder höher festgestellt, so ist davon auszugehen, dass die Reaktionen der Versuchstiere, die über die schwerste Reaktion der Kontrolltiere hinausgehen, auf eine Sensibilisierung zurückzuführen sind.

Weitere Daten finden Sie in den „Ergänzenden Materialien“.

Die Studie wurde gemäß ISO 10993-1018 durchgeführt. Der Testartikel wurde wie oben beschrieben mit Natriumchlorid und Baumwollsamenöl extrahiert. Der Test wurde an Neuseeland-Kaninchen durchgeführt. Weitere Daten finden Sie in den „Ergänzenden Materialien“.

Die Studie wurde gemäß ISO 10993-1018 durchgeführt. Vier Gruppen von je 5 BALB/c-Mäusen wurden 50 ml/kg Natriumchlorid-Extrakt, Baumwollsamenöl-Extrakt sowie die polaren und unpolaren Lösungsmittelkontrollen injiziert. Polare und unpolare Extrakte und Lösungsmittelkontrollen wurden intraperitoneal injiziert. Die Tiere wurden einer klinischen Untersuchung unterzogen und 24 ± 2 Stunden, 48 ± 2 Stunden und 72 ± 2 Stunden nach der Injektion gewogen. 72 ± 2 Stunden nach der Injektion wurden die Tiere eingeschläfert.

Basierend auf ISO 10993-6 und ISO 10993-11 wurde NE'X Glue auf subchronische Toxizität in Kombination mit Implantation unter Verwendung von BioGlue als Referenzmaterial bewertet19,20.

Vor der Behandlung wurde das Fell auf dem Rücken jeder Ratte (Wistar) über dem Testbereich abgeschnitten, um mechanische Reizungen und Traumata zu vermeiden. Die Implantationsstelle wurde mit Jodlösung desinfiziert. Der Eingriff wurde unter Vollnarkose mit Isofluran durchgeführt. Bei Bedarf wurde den Tieren Butorphanol (2 mg/kg) subkutan injiziert. Während der Operation wurde die Haut in einer paraspinalen Linie eingeschnitten, um separate Taschen im Unterhautgewebe zu schaffen. Auf beiden Flanken des Tieres wurden in gleichen Abständen Implantate platziert. Pro Ratte wurden 8 Implantate des getesteten Artikels oder des Kontrollartikels implantiert. Basierend auf dem maximalen Volumen an NE'X-Kleber, das pro Patient und dem statistischen Gewicht des Menschen (60 kg) verwendet werden sollte, wurden jedem Tier 8 Implantate von 0,04 ml implantiert. Basierend auf dem Gewicht der Tiere beträgt die bewertete Menge des getesteten Produkts mehr als das Zehnfache der im klinischen Umfeld verwendeten Dosis. Die Wunden wurden mit nicht resorbierbaren Fäden verschlossen. Jedem Tier wurde drei Tage nach der Implantation subkutan Meloxicam (1 mg/kg) injiziert. Die Tiere wurden eine Woche lang getrennt gehalten, bis die Wunde verheilt war, und dann wurden sie zusammengebracht. Die Tiere wurden 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 90 Tage nach der Implantation gewogen und beobachtet.

Nach dem Beobachtungszeitraum wurden Urin- und Blutproben entnommen. Bei allen Tieren wurden Routinetests wie Hämatologie und klinische Chemie durchgeführt. Kurz gesagt, die Tiere wurden mit Ketamin/Xylazin (100 mg/kg – Ketamin, 10 mg/kg – Xylazin) anästhesiert und Blut wurde in K2-EDTA-Röhrchen für Hämatologie und Heparin für die klinische Chemie entnommen. Die Gesamtzahl an WBC, Hb, RBC, PCV, Retikulozyten und Thrombozyten wurde mit einem Hämatologie-Analysegerät bestimmt. ALP, ALAT, ASAT, GGT, Glukoseplasmakonzentration, Gesamtprotein, Albumin, Harnstoff, Kreatinin, Gesamtcholesterin, Gesamtbilirubin, Phospholipide, Triglyceride, Cl−, Ca2+, Na+, K+ und anorganisches Phosphat wurden mit einem biochemischen Analysegerät bestimmt.

Weitere Daten finden Sie in den „Ergänzenden Materialien“.

Bei allen in der Studie verwendeten Kaninchen (Neuseeland) wurde 14 Tage vor dem Test ein negativer Pyrogentest durchgeführt (jedes Kaninchen hatte nach dem negativen Pyrogen-Vortest eine Ruhezeit von mindestens 3 Tagen).

Die Temperatur jedes Kaninchens wurde vor der Injektion 90 Minuten lang alle 30 Minuten mit einer thermometrischen Rektalsonde aufgezeichnet, die nicht weniger als 7,5 cm, aber nicht mehr als 9 cm eingeführt wurde. Die Kaninchen, die bei der anfänglichen Temperaturbestimmung eine Temperaturschwankung von zwei aufeinanderfolgenden Messwerten von mehr als 0,2 °C oder eine Temperatur von mehr als 39,6 °C oder weniger als 38,2 °C zeigten, wurden von der Studie ausgeschlossen. Die Anfangstemperatur jedes Kaninchens wurde als Mittelwert zweier Temperaturen bestimmt, die in Abständen von 30 Minuten vor der Injektion aufgezeichnet wurden. In der Gruppe betrug der Unterschied zwischen den drei Anfangstemperaturen nicht mehr als 1 °C.

Nach der Extraktion wurde die getestete Lösung auf 38,5 °C äquilibriert und in einer Dosis von 10 ml/kg Körpergewicht intravenös durch die Randohrvene injiziert. Die Temperatur jedes Kaninchens wurde 3 Stunden lang nach der Injektion alle 30 Minuten aufgezeichnet. Der maximale Anstieg jedes Kaninchens wurde am Ende des Tests bestimmt. Akzeptanzkriterien für den Pyrogenitätstest sind in den „Ergänzenden Materialien“ dargestellt.

Die Studie wurde gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der I. Lokalen Ethikkommission in Warschau mit den Protokollcodes 738/2018, 879/2019 und 864/2019 genehmigt. Alle Tierversuchsmethoden wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien geplant und berichtet.

Die Bestimmung der Extraktionsbedingungen für die umfassende Extraktion von N'EX-Kleber ergab, dass Hexan und Isopropanol zu einer Verschlechterung des Produkts und einer Veränderung der Fahrzeugfarbe führen. Daher wurde gemäß ISO 10993-18 nur der Wasserextrakt analysiert.

In der Studie wurden keine VOCs über AET identifiziert.

Es wurden keine Elemente oberhalb der Nachweisgrenze identifiziert. Ein Vergleich von LODs und parenteraler PDE ist in Tabelle 2 dargestellt.

Der Zellkulturmediumextrakt von NE'X Glue zeigte im MEM-Elutionstest kein zytotoxisches Potenzial für L-929-Mausfibroblasten. Die Eignung des Testsystems wurde anhand der bei den Positiv- und Negativkontrollen beobachteten Zellreaktion bestätigt.

Die Ergebnisse des Zytotoxizitätstests sind in Tabelle 3 und Abb. 2 dargestellt.

Bilder von Zellen nach Exposition gegenüber chirurgischen Klebstoffextrakten, Negativ- und Positivkontrollen in der MEM-Elutionsstudie.

Jeder im Test verwendete Bakterienstamm, sowohl mit als auch ohne S9-Fraktion, bestand die internen Qualitätskontrollen. N'EX Glue zeigte nur dann eine unklare mutagene Wirkung, wenn es dem Stamm TA1535 in Gegenwart der S9-Fraktion ausgesetzt wurde. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4 und 5 dargestellt.

Die analysierten und zusammengefassten Daten sind in der folgenden Tabelle 5 dargestellt. In dieser Studie wurden weder Niederschläge noch Toxizität beobachtet.

Wenn der MF über dem globalen Bewertungsfaktor von 126 (× 10–6) gegenüber der Negativkontrolle liegt, gilt die Probe als mutagen. Die Akzeptanzkriterien für MLA wurden bereits beschrieben13. In dieser Studie wurde keine Toxizität oder Ausfällung beobachtet. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 6, 7, 8, 9, 10 und 11 dargestellt.

Die Endotoxinkonzentration von NE'X Glue betrug 0,028 EU/ml für eine nicht aufgestockte Probe und 0,428 EU/ml für eine aufgestockte Probe. Der berechnete Endotoxingehalt pro maximaler Gerätegröße beträgt 0,29 EU. Die Ergebnisse und die Standardkurve sind in Abb. 3 dargestellt.

Standardkurve und Ergebnisse der Endotoxinkonzentration.

Jeden Tag wurden Tiere beobachtet. Es wurden keine Anzeichen von Anomalien festgestellt. Keines der untersuchten Tiere verlor 10 % oder mehr Körpergewicht und keines der Tiere starb. Darüber hinaus wurde in Testprobenextrakten und Lösungsmittelkontrollen ein Sensibilisierungspotenzial von 0 % beobachtet. Daher betrug der Sensibilisierungsgrad für jede Testgruppe (Natriumchlorid und Baumwollsamenölextrakte) und die Lösungsmittelkontrollgruppe 0 gemäß der Mangusson- und Kligman-Skala.

Der primäre Irritationsindex (PII) für beide Extrakte wurde durch Subtraktion des gesamten primären Irritationsscores der Kontrollgruppe vom gesamten primären Irritationsscore der Studiengruppe ermittelt. Für Baumwollsamenöl- und Natriumchloridextrakte von NE'X Glue Surgical Adhesive wurde der Primärreizungsindex mit 0,48 bzw. 0,00 berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 dargestellt. Proben, bei denen der Gesamtwert der primären Reizung unter 1 liegt, gelten als nicht reizend.

Keine Kontroll- oder Testtiere zeigten zu irgendeinem Beobachtungszeitpunkt offensichtliche Anzeichen von Toxizität, aufgeführt in Tabelle C.1, Anhang C – Häufige klinische Anzeichen und Beobachtungen, ISO 10993-1120. Keines der mit der Testprobe behandelten Tiere zeigte im Beobachtungszeitraum eine signifikant höhere biologische Reaktivität als in der Kontrollgruppe. Keines der Tiere starb und keines der Tiere verlor 10 % oder mehr Körpergewicht. Die Veränderungen des Körpergewichts sind in Abb. 4 dargestellt.

Veränderungen des Körpergewichts.

Bei der makroskopischen Autopsie wurden keine Auffälligkeiten beobachtet. Subkutane Implantationsstellen und das umliegende Gewebe zeigten keine Anomalien. Bei der makroskopischen Autopsie wurden Nieren, Lunge, Leber, Herz, Gehirn, Eierstöcke/Hoden und Milz gewogen. Das Organgewicht wurde in % des Körpergewichts des Tieres angegeben. Die Testergebnisse sind in den Abbildungen dargestellt. 6, 7, 8, 9 und 10.

Organgewicht in (%) des Körpergewichts. Statistisch signifikante Unterschiede wurden beim Vergleich der Kontroll- und Testgruppe der männlichen Gehirne und Nieren beobachtet, die Ergebnisse hatten jedoch keinen Einfluss auf das klinische Bild der Tiere. Die makroskopischen und mikroskopischen Beobachtungen zeigten keine Auffälligkeiten. Es wurden keine weiteren statistisch signifikanten Unterschiede zwischen der Test- und der Kontrollgruppe beobachtet.

Biochemische Befundergebnisse. Statistisch gesehen wurden signifikante Unterschiede in den Cl- und ALT-Spiegeln zwischen der Kontrollgruppe und der Testgruppe weiblicher Ratten beobachtet. Außerdem wurden bei männlichen Ratten Unterschiede im Kreatininspiegel zwischen Test- und Kontrollgruppe beobachtet. Der Unterschied hatte jedoch keinen Einfluss auf den klinischen Zustand der Tiere. Bei den übrigen Parametern wurden keine weiteren statistisch signifikanten Unterschiede beobachtet.

Ergebnisse biochemischer Befunde. Statistisch gesehen wurden signifikante Unterschiede bei den Triglycerid-, Na- und P-Spiegeln zwischen der Kontroll- und der Testgruppe männlicher Ratten beobachtet. Der Unterschied hatte jedoch keinen Einfluss auf den klinischen Zustand der Tiere. Bei den übrigen Parametern wurden keine weiteren statistisch signifikanten Unterschiede beobachtet.

Hämatologische Befunde. Statistisch signifikante Unterschiede wurden bei HCT, Leukozyten, Lymphozyten und Monozyten zwischen der Kontroll- und Testgruppe weiblicher Ratten sowie HCT bei männlichen Ratten beobachtet. Der Unterschied hatte jedoch keinen Einfluss auf den klinischen Zustand der Tiere. Bei den übrigen Parametern wurden keine weiteren statistisch signifikanten Unterschiede beobachtet.

Ergebnisse des Urintests. Statistisch signifikante Unterschiede wurden im Urin-pH-Wert zwischen der Kontroll- und der Testgruppe männlicher Ratten beobachtet. Der Unterschied hatte jedoch keinen Einfluss auf den klinischen Zustand der Tiere. Bei den übrigen Parametern wurden keine weiteren statistisch signifikanten Unterschiede beobachtet.

Anstelle einer vollständigen Histopathologie gemäß ISO 10993-1120 wurde eine begrenzte Analyse durchgeführt. Kurz gesagt wurden zwei repräsentative Tiere sowohl aus der Studien- als auch der Kontrollgruppe ausgewählt. Folgende Organe wurden untersucht: Knochen, Knochenmark, Herz, Leber, Lunge, Nieren, Eierstöcke/Hoden und Milz. Bei der histopathologischen Untersuchung wurden keine Anomalien festgestellt. Auf mikroskopischer Ebene war die Struktur des Organs normal und es gab keine Anzeichen einer Apoptose der Strukturzellen einzelner Organe. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen der Studien- und der Kontrollgruppe beobachtet. Die Ergebnisse der histologischen Untersuchung sind in Tabelle 13 dargestellt.

Gemäß ISO 10993-6 wurden die doppelten „Zelltyp-Reaktions-Scores“ und „Gewebe-Reaktions-Scores“ zusammengefasst und durch die Anzahl der Gruppen dividiert, um den durchschnittlichen Score für Studien- und Kontrollgruppen zu berechnen19. Die „endgültige Reaktionsbewertung“ wurde durch Subtrahieren der durchschnittlichen Negativkontrollbewertung von der durchschnittlichen Bewertung der getesteten Probe ermittelt. Die Reaktionsbewertung für NE'X Glue betrug −6,3 (0), was als minimale oder keine Reaktion eingestuft wird.

Kein Kaninchen zeigte einen individuellen Temperaturanstieg von mehr als 0,6 °C über seine Ausgangstemperatur. Die Ergebnisse des Pyrogenitätstests sind in Tabelle 14 aufgeführt.

Die zusammengefassten Ergebnisse der Biokompatibilitätstests von NE'X Glue sind unten in Tabelle 15 dargestellt.

Das Hauptziel der Biokompatibilitätsbewertung besteht darin, Menschen vor potenziellen biologischen Risiken zu schützen, die durch die Verwendung von Medizinprodukten entstehen. Die Normen der ISO 10993-Familie bieten Leitlinien zur biologischen Bewertung von Medizinprodukten im Risikomanagementprozess als Teil der Gesamtbewertung und Entwicklung jedes Medizinprodukts. Der Bewertungsprozess umfasst mehrere Schritte und sein einziger Zweck besteht darin, vorherzusagen, ob das getestete Gerät für den klinischen Einsatz sicher ist. Da sich die Medizinprodukte hinsichtlich ihres Verwendungszwecks, ihrer Komplexität und des damit verbundenen Risikos unterscheiden, müssen die durchzuführenden Tests entsprechend ausgewählt werden.

NE'X Glue wird nach mehr als 24 Monaten biologisch abgebaut und vom Körper resorbiert. Daher wird NE'X Glue gemäß Tabelle A.1 in ISO 10993-17,21 als Implantat eingestuft, das über einen längeren Zeitraum (mehr als 30 Tage) mit Gewebe in Kontakt kommt. Da es sich um ein Gerät mit potenziell hohem Risiko handelt, müssen die durchgeführten Tests in der Lage sein, alle erforderlichen Endpunkte gemäß ISO 10993-1 zu bewerten. Vorläufige Tests der Extraktionsbedingungen, die für die chemische Analyse von NE'X-Kleber geeignet sind, zeigten, dass semipolare und unpolare Lösungsmittel zu einer Verschlechterung der Probe führen. Daher wurde für die chemische Prüfung ausschließlich Wasser verwendet. Wir haben keine Verbindungen über AET beobachtet. Aufgrund dieser Ergebnisse war keine weitere toxikologische Bewertung erforderlich. Außerdem ergab die ICP-MS-Analyse keine Elemente über LOD, die niedriger waren als die in den ICH Q3D(R1)-Richtlinien22 festgelegten Grenzwerte für parenterale PDE. Daher zeigte die chemische Analyse der NE'X-Glue-Extrakte, dass mit der Zusammensetzung des untersuchten Produkts kein toxikologisches Risiko verbunden ist.

Darüber hinaus zeigte der AMES Penta 2-Assay, dass NE'X Glue für keinen der im Test verwendeten Stämme ein mutagenes Potenzial aufweist, weder mit noch ohne Anwesenheit der S9-Fraktion. Um zu bestätigen, dass NE'X Glue nicht mutagen ist, insbesondere im eukaryotischen System, wurde der Maus-Lymphom-Assay (MLA) durchgeführt. Das getestete Produkt zeigte unter keiner der getesteten Bedingungen (4 Stunden mit und ohne Stoffwechselaktivierung und 24 Stunden ohne Stoffwechselaktivierung) mutagene Wirkungen und sollte daher als nicht mutagen angesehen werden. Die kombinierten Ergebnisse der chemischen, mutagenen und genotoxischen Tests zeigen, dass das mit der Verwendung von NE'X Glue verbundene Karzinogeneserisiko vernachlässigbar ist. Der Mangel an besonders besorgniserregenden Stoffen (SVHCs), bei denen es sich um krebserzeugende, erbgutverändernde oder fortpflanzungsgefährdende Stoffe und Verbindungen mit endokrinschädigenden Eigenschaften handelt, sowie das Fehlen eines genotoxischen und mutagenen Potenzials von NE'X Glue zeigen diese Verwendung Dieses Gerät ist auch bei Patienten mit genetischen Anomalien sicher und das Auftreten späterer Nebenwirkungen ist unwahrscheinlich.

Eine potenzielle Kontamination medizinischer Geräte mit Endotoxinen kann ein ernstes Gesundheitsrisiko darstellen, das zu erheblichen kurz- und langfristigen Komplikationen führt, einschließlich einer abnormalen Liquorverteilung, akuten Entzündungen, einer Verschlechterung der Organfunktion und gestörten humoralen und zellulären Vermittlungssystemen23,24. Der allgemeine Endotoxingrenzwert für Medizinprodukte, die zur Verwendung bei Erwachsenen bestimmt sind, liegt bei 20 EU/Gerät, während für Verfahren, bei denen es zu einem Kontakt mit Liquor kommt, der Grenzwert bei 2,15 EU/Gerät liegt25. Der Endotoxingehalt der maximalen Größe des Produkts wurde gemäß 85. Bacterial Endotoxin Test, US Pharmacopeia26 bewertet und beträgt 0,29 EU pro 10-ml-Gerät. Die Ergebnisse zeigen, dass der NE'X-Kleber nicht nur deutlich unter dem Grenzwert für Medizinprodukte liegt, sondern auch bei Eingriffen mit Kontakt zum Gehirn-Rückenmark bedenkenlos eingesetzt werden kann. Darüber hinaus wurden In-vitro-Ergebnisse mit der Kaninchen-Pyrogenstudie gemäß ISO 10993-1120 bestätigt, die bewiesen, dass kein pyrogenes Potenzial besteht.

Die gemäß ISO 10993-5 durchgeführte Zytotoxizitätsanalyse zeigte, dass NE'X Glue im MEM-Elutionsassay für L-929-Mausfibroblastenzellen nicht zytotoxisch ist. Dieser Test ist aufgrund des Vorhandenseins von Aldehyd im untersuchten Medizinprodukt von entscheidender Bedeutung. Die Einwirkung von Aldehyd auf Gewebe und Zellen kann zu Reizungen, Sensibilisierungen und/oder Nekrosen führen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Aldehydlösung das Albumin wirksam vernetzt und nicht aus dem Klebstoff austritt. Dies weist darauf hin, dass bei der klinischen Verwendung des bewerteten chirurgischen Klebstoffs kein Risiko einer Gewebenekrose oder Entzündung besteht. Die In-vitro-Ergebnisse zu den Risiken von NE'X Glue im Zusammenhang mit Reizungen und Sensibilisierungspotenzial wurden durch In-vivo-Studien weiter bestätigt. Das Potenzial, eine allergische Reaktion hervorzurufen, wurde mit dem Meerschweinchen-Maximierungstest bewertet, während das Reizpotenzial mit dem Intrakutanen Reaktivitätstest untersucht wurde. Die Ergebnisse beider Tests zeigten, dass mit der Verwendung von NE'X Glue kein sensibilisierendes oder reizendes Potenzial verbunden ist. Die Ergebnisse akuter systemischer Toxizitätstests liefern Informationen über die unmittelbaren Risiken, die mit der Verwendung eines Medizinprodukts verbunden sind, während subchronische systemische Toxizitätstests in Kombination mit der Implantation Daten über den Langzeitkontakt liefern. Die Ergebnisse von In-vivo-Studien zeigten kein unmittelbares oder anhaltendes Toxizitätsrisiko im Zusammenhang mit der Verwendung von NE'X Glue Surgical Adhesive, obwohl die Dosis mehr als das Zehnfache der menschlichen Dosis betrug, was darauf hindeutet, dass es unabhängig vom Gesundheitszustand des Patienten verwendet werden kann Zustand.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass NE'X Glue eine sehr gute Biokompatibilität aufwies und als sicher in der Anwendung gelten sollte. Daher ist NE'X Glue ein neuer und vielversprechender chirurgischer Klebstoff mit zahlreichen Einsatzmöglichkeiten.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Zusätzliche Informationen und Daten zur chemischen Charakterisierung, MLA, Medienzusammensetzungen, AMES-Assay, intrakutaner Reaktivität, subchronischer Toxizität, Sensibilisierung und Pyrogenität in Kombination mit Implantation in den Tabellen S1–Tabellen S21.

Analytische Bewertungsschwelle

Bakterieller Reverse-Mutationstest

Lokaler Lymphknotentest

Lymphknotenzellen

Maus-Lymphom-Assay

Positive Kontrolle

Relative Beschichtungseffizienz

Relatives Suspensionswachstum

Relatives Gesamtwachstum

Sensibilisierungsindex

Halbflüchtige organische Verbindung

Gesamte Elementexposition

Flüchtige organische Verbindung

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Referenzen herunterladen

Abteilung für Molekularbiologie, Institut für Genetik und Tierbiotechnologie, Polnische Akademie der Wissenschaften, Postępu 36A, 05-552, Magdalenka, Polen

Lukasz Szymanski

Europäisches Biomedizinisches Institut, Nalkowskiej 5, 05-410, Jozefow, Polen

Lukasz Szymanski, Kamila Gołaszewska, Anna Wiatrowska, Monika Dropik, Patrycja Krakowiak, Justyna Małkowska und Damian Matak

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Konzeptualisierung, L.Sz. und DM; Datenkuration, AW, MD, PK, KG und JW; formale Analyse, AW; Finanzierungsakquise, DM; Untersuchung, L.Sz., AW, MD, PK, KG und JM; Methodik, KG, L.Sz., AW, MD, PK, JW und DM; Aufsicht, L.Sz. und DM; Schreiben – Originalentwurf, L.Sz.; Schreiben – Rezension und Bearbeitung, L.Sz. und DM Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Damian Matak.

Dr. Damian Matak und Dr. Łukasz Szymański haben den chirurgischen Klebstoff NE'X Glue erfunden. Alle Tests wurden in einem nach ISO 17025 akkreditierten und GLP-zertifizierten Labor durchgeführt, um die Datenintegrität sicherzustellen. Alle Autoren haben kein finanzielles Interesse an NE'X Glue Surgical Adhesive.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Szymanski, L., Gołaszewska, K., Wiatrowska, A. et al. Biokompatibilität eines neuartigen chirurgischen Albumin-Aldehyd-Klebstoffs. Sci Rep 12, 12749 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16853-5

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Eingegangen: 11. Mai 2022

Angenommen: 18. Juli 2022

Veröffentlicht: 26. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16853-5

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