Serin-ADP

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3200 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bei der DNA-Schadensreaktion von Säugetieren ist die ADP-Ribosylierungssignalisierung von entscheidender Bedeutung, um DNA-Schadensstellen zu markieren und Reparaturfaktoren zu rekrutieren und zu regulieren. Insbesondere erkennt der PARP1:HPF1-Komplex beschädigte DNA und katalysiert die Bildung von Serin-verknüpften ADP-Ribosylierungsmarkierungen (Mono-Ser-ADPr), die durch PARP1 allein in ADP-Ribose-Polymere (Poly-Ser-ADPr) verlängert werden. Poly-Ser-ADPr wird durch PARG umgekehrt, während das terminale Mono-Ser-ADPr durch ARH3 entfernt wird. Trotz seiner Bedeutung und offensichtlichen evolutionären Erhaltung ist wenig über die ADP-Ribosylierungssignalisierung in Nicht-Säugetier-Animalia bekannt. Das Vorhandensein von HPF1, aber das Fehlen von ARH3 in einigen Insektengenomen, einschließlich Drosophila-Arten, wirft Fragen hinsichtlich der Existenz und Umkehrung der Serin-ADP-Ribosylierung bei diesen Arten auf. Hier zeigen wir durch quantitative Proteomik, dass Ser-ADPr die Hauptform der ADP-Ribosylierung in der DNA-Schadensreaktion von Drosophila melanogaster ist und vom dParp1:dHpf1-Komplex abhängig ist. Darüber hinaus decken unsere strukturellen und biochemischen Untersuchungen den Mechanismus der Mono-Ser-ADPr-Entfernung durch Drosophila Parg auf. Insgesamt zeigen unsere Daten, dass PARP: HPF1-vermitteltes Ser-ADPr ein bestimmendes Merkmal der DDR in Animalia ist. Die bemerkenswerte Erhaltung innerhalb dieses Königreichs legt nahe, dass Organismen, die nur einen Kernsatz an ADP-Ribosyl-metabolisierenden Enzymen tragen, wie Drosophila, wertvolle Modellorganismen für die Untersuchung der physiologischen Rolle der Ser-ADPr-Signalübertragung sind.

ADP-Ribosylierung (ADPr) ist eine posttranslationale Modifikation von Proteinen, die die Übertragung von ADP-Ribose-Anteilen von NAD+ auf ein Zielprotein beinhaltet. Es ist an der Regulierung einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt, unter anderem an der DNA-Reparatur, der Transkriptionsregulierung, der Immunität und dem mikrobiellen Stoffwechsel1,2,3,4. ADP-Ribose-Einheiten können an eine Vielzahl von Aminosäureseitenketten angehängt werden, unter anderem mit sauren (Glu/Asp), basischen (Arg/Lys), Hydroxyl- (Ser/Tyr) und Thiol- (Cys) Funktionalitäten2,5. Einige Autoren wie PARP1, PARP2 und Tankyrase1/2 (auch PARP5a/b genannt) können die anfängliche Modifikation, die als Mono(ADP-Ribosylierung) (MARylierung) bekannt ist, erweitern und lineare oder verzweigte ADP-Ribose-Polymere erzeugen, die als Poly(ADP) bekannt sind -Ribosylierung) (PARylierung)6,7,8.

Die Bindung von PARP1/2 induziert das PARP1/2-abhängige Protein ADPr an DNA-Brüchen, was zu ADPr-Signalen führt, die eine Vielzahl von DNA-Schadensreaktionsmechanismen (DDR) aktivieren und steuern, die für die Zerlegung von Chromatin und die Rekrutierung von Reparaturfaktoren erforderlich sind4 ,9. Frühere Studien zeigten, dass PARP1 und PARP2 die Glutamat-/Aspartat-Modifikation in vitro katalysieren10, während massenspektrometrische Analysen ergaben, dass Serin-ADPr der Hauptrest ist, der während der DNA-Schädigung in menschlichen Zellen durch ADPr modifiziert wird11,12,13,14. Diese Diskrepanz wurde mit der Entdeckung des Hilfsproteins Histon PARylation Factor 1 (HPF1)11,15 behoben, das das aktive Zentrum von PARP1/2 vervollständigt, indem es substratbindende und katalytische Reste beisteuert16,17,18. Darüber hinaus ist der PARP1/2:HPF1-Komplex auch für die weniger verstandene Modifikation von Tyrosinresten verantwortlich19,20.

ADPr ist hochdynamisch und muss aufgrund des damit verbundenen hohen Energieaufwands streng reguliert werden. Sobald daher eine geeignete zelluläre Reaktion erreicht wurde, hört die ADPr-Signalisierung auf und die verwendeten ADP-Ribose-Einheiten werden von speziellen Radierern recycelt, die die ADP-Ribose in andere Nukleotide, einschließlich ATP und NAD+21, umwandeln. Das Hauptenzym, das für den Abbau des Großteils der PAR-Ketten verantwortlich ist, ist Poly(ADP-Ribose)glycohydrolase (PARG), das die Acetalbindung innerhalb des ADP-Ribose-Polymers hydrolysiert, aber die Protein-Ribose-Bindung nicht umkehren kann22,23,24. In menschlichen Zellen wird diese spezifische Reaktion, die Entfernung von Ser-ADPr, durch (ADP-Ribosyl)hydrolase 3 (ARH3)23,25 durchgeführt.

Insbesondere ist das Zusammenspiel der ADPr-Etablierung durch die PARP1/2:HPF1-Komplexe mit der schrittweisen Entfernung von Modifikationen durch PARG und ARH3 von wesentlicher Bedeutung für die Kontrolle der DNA-Reparatur und die Regulierung der Chromatinstruktur8,15,26,27,28. Kürzlich wurde auch gezeigt, dass diese Komponenten entscheidende Determinanten der Reaktion auf klinisch relevante PARP-Inhibitoren sind27,29,30. Trotz der Bedeutung der Ser-ADPr-Signalübertragung bei Säugetieren bleibt ihre Relevanz für Animalia außerhalb der Säugetierlinie unklar. Während PARPs und ADPr bereits in Drosophila melanogaster31 untersucht wurden, muss die Art des vorwiegend mit ADPr modifizierten Rückstands in diesem Modellorganismus noch geklärt werden. Es wurde auch gezeigt, dass Drosophila Parp (dParp) und Parg (dParg) an mehreren biologischen Funktionen wie DDR32, Transkriptionsregulation33,34 und Chromatin-Remodellierung35,36,37,38,39 beteiligt sind. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass dParp ein essentielles Gen in Drosophila ist, dessen Deletion beim Übergang vom Larven- zum Puppenstadium tödlich ist34,40. Die Expression von Mutationen mit Funktionsverlust von dParg induziert auch bei 25 °C einen tödlichen Larvenphänotyp. Allerdings konnten 25 % der mutierten Fliegen bei 29 °C das Erwachsenenstadium erreichen, obwohl sie einen progressiven Neurodegenerationsphänotyp aufwiesen, der mit der PAR-Akkumulation in Neuronen zusammenhängt41. Darüber hinaus führte die Manipulation der dParp- oder dParg-Genexpressionsniveaus zu veränderten Phänotypen in Fliegenmodellen neurodegenerativer Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit42,43, der Alzheimer-Krankheit44 und der amyotrophen Lateralsklerose45. Es ist jedoch nicht bekannt, ob dParp mit dHpf1 zusammenarbeitet und, wenn ja, ob die resultierende Modifikation überwiegend auf Serinresten lokalisiert ist.

Hier berichten wir über die Existenz eines reichlich vorhandenen und konservierten Ser-ADPr-Signalsystems in Drosophila, das durch dParp:dHpf1 katalysiert wird und dessen Funktionalität weitgehend mit der DDR-induzierten ADPr-Signalübertragung beim Menschen vergleichbar ist. Wir zeigen weiterhin, dass Drosophila zwar ARH3 fehlt, es jedoch eine bemerkenswerte evolutionäre Anpassung von dParg gibt, die sowohl menschlichem PARG als auch ARH3 funktionelle Äquivalenz verleiht. Die Konservierung und relative Einfachheit des Ser-ADPr in Drosophila – mit nur einem DNA-Reparatur-assoziierten PARP und einer entgegengesetzten Hydrolase – macht Fruchtfliegen zu einem attraktiven Modell für die weitere Untersuchung dieser wichtigen Modifikation.

Bisher wurde Ser-ADPr nur an Wirbeltieren untersucht. Unsere phylogenetische Analyse ergab, dass HPF1 in praktisch allen Metazoa konserviert wurde, einschließlich primitiver Zweige wie Korallen und Schwämme sowie Organismen, die für häufige Genverluste bekannt sind, wie D. melanogaster und Caenorhabditis elegans (Abb. 1 und ergänzende Daten 1). Darüber hinaus kommt HPF1 in vielen Protozoen vor. In ähnlicher Weise ist ARH3 unter den Metazoa weit verbreitet, kommt jedoch nur sporadisch in den Amoebazoa und Alveolata vor (Supplementary Data 1). Das Auftreten dieser beiden entscheidenden Gene für die Etablierung und Entfernung von Ser-ADPr in der frühen Evolution des Animalia-Königreichs lässt stark darauf schließen, dass dies der Ursprung dieser Signalvariation der ADP-Ribosylierung ist. Überraschenderweise ergab unsere Analyse, dass ARH3 in mehreren eukaryotischen Abstammungslinien fehlt, darunter Nematoda, Lepidoptera und die meisten Diptera, einschließlich aller Drosophila-Arten. Diese ARH3-defizienten Arten behalten jedoch weiterhin den Haupt-PAR-Degrader PARG sowie HPF1. Diese Ergebnisse legen nahe, dass sich der Ser-ADPr-Zyklus bei Drosophila möglicherweise von dem anderer Metazoa unterscheidet und daher eine detailliertere Untersuchung erfordert.

Der phylogenetische Baum wurde mit Aminosäuresequenzen erstellt, die durch Mehrfachsequenz-Alignment aus ihrem gesamten Proteinkontext isoliert wurden. Die Evolutionsgeschichte wurde mithilfe der Maximum-Likelihood-Methode unter dem LG-Modell der Aminosäuresubstitution, wie in MEGA11 implementiert, abgeleitet. Der Bootstrap-Konsensbaum wird angezeigt und wurde aus 1000 Replikaten abgeleitet, um die Evolutionsgeschichte der analysierten Taxa darzustellen. Arten, bei denen durch die BLAST-Suche kein ARH3 identifiziert werden konnte, werden rot hervorgehoben. Relevante Gruppen werden durch farbige Zweige hervorgehoben (Insecta, blau; Mammalia, grün; Nematoda, orange; Protozoa, braun). Sequenzdaten finden Sie in den Zusatzdaten 1.

Um diese Hypothese zu untersuchen, haben wir zunächst bestätigt, dass alle Komponenten – dParp, dHpf1 und dParg – in S2R+-Zellen im Zellkern lokalisiert sind (ergänzende Abbildung 1A), bevor wir mit der Aufklärung der ADPr-Dynamik in Drosophila nach einer DNA-Schädigung fortfuhren. Wir setzten S2R+-Zellen einer DNA-Schädigung durch Wasserstoffperoxid (H2O2) und Methylmethansulfonat (MMS) aus und verglichen dann das ADPr-Muster vor und nach der DNA-Schädigung unter Verwendung verschiedener Anti-ADPr-Antikörper und Reagenzien (Abb. 2A). Wir beobachteten, dass ADPr nach H2O2-Exposition schnell (< 10 Min.) induziert wird und nach Stress schnell abgebaut wird (< 120 Min.; Abb. 2A). Im Gegensatz dazu zeigte das Alkylierungsmittel MMS unter den gleichen Testbedingungen eine weniger ausgeprägte ADPr-Reaktion, vergleichbar mit U2OS-Zellen (Abb. 2A). Das Gesamtmuster von Poly-ADPr spiegelt das von menschlichen U2OS-Zellen mit markanten Banden wider, die Histonen und PARP1 entsprechen. Obwohl wir einen anderen Ursprung des Signals nicht vollständig ausschließen können, besteht eine offensichtliche Ähnlichkeit des S2R+ ADPr-Signals mit der menschlichen U2OS-Zelle, für die Histone und hPARP1 als die beiden Hauptziele von durch DNA-Schäden verursachtem ADPr11,12,15 berichtet wurden. deutet stark darauf hin, dass dieses ADPr-Signal mit Histonen und dParp zusammenhängt. Darüber hinaus zeigten diese Daten, dass Drosophila- und menschliche Zellen eine vergleichbare ADPr-Dynamik als Reaktion auf DNA-Schäden aufweisen14,15,25. Um festzustellen, ob dParp und dHpf1 aktiv an Stellen mit DNA-Läsionen rekrutiert werden, wurden S2R+-Zellen mit GFP-dParp oder GFP-dHpf1 transfiziert und einer Laser-Mikrobestrahlung in Verbindung mit der Bildgebung lebender Zellen unterzogen (Abb. 2B). Wir beobachteten eine starke Rekrutierung von dParp an Schadensstellen innerhalb von Sekunden nach der laserinduzierten Schädigung, vergleichbar mit dem, was für hPARP128,46 beschrieben wurde. In ähnlicher Weise beobachteten wir auch die schnelle Rekrutierung von dHpf1 an Schadensstellen, wenn auch nicht im gleichen Ausmaß wie dParp. Dies ahmt das menschliche Rekrutierungsprofil nach, bei dem PARP1 die HPF1-Rekrutierung übersteigt28.

Drosophila S2R+- und menschliche U2OS-Zellen wurden entweder mit 2 mM H2O2 oder 5 mM MMS behandelt und zu den angegebenen Zeitpunkten analysiert. Die Zellen wurden lysiert und die Proteine ​​durch SDS-PAGE aufgetrennt und dann durch Immunoblot auf Poly-ADPr-Spiegel analysiert. Als Ladungskontrollen wurden Actin- und Ponceau-S-Färbungen verwendet. Die Beschriftungen „PARP“ und „Histone“ neben dem Bild geben die ungefähren Größen an, in denen diese Proteine ​​gefunden werden können. Das Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. B Repräsentative Bilder (oben) und Kinetik (unten) der Rekrutierung von EGFP-dParp und EGFP-dHpf1 an Stellen mit DNA-Schäden, die durch 405-nm-Laserbestrahlung in Drosophila S2R+-Zellen induziert wurden. Maßstabsbalken, 2 µm. Die Daten von B sind repräsentativ für 3 unabhängige Replikate (6–10 Zellen pro Replikat pro Bedingung) mit n = 24 Zellen für EGFP-dParp und n = 22 Zellen für EGFP-dHpf1 und stellen normalisierte Mittelwerte ± SEM dar. Bestrahlungsorte sind durch gelbe Pfeile gekennzeichnet. C S2R+-Zellen wurden 16 Stunden lang mit DMSO oder 2 μM PARGi (PDD00017273) vorbehandelt, gefolgt von einer Behandlung mit 2 mM H2O2 für die angegebene Zeit in Abwesenheit oder Anwesenheit von PARGi. Die Konzentrationen von Poly-ADPr (linkes Feld) und Pan-ADPr (rechtes Feld) wurden mittels Immunoblot analysiert. Die Beschriftungen „PARP“ und „Histone“ neben dem Bild geben die ungefähren Größen an, in denen diese Proteine ​​gefunden werden können. Das Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Die kanonische PAR-Hydrolase-Aktivität von dParg wurde gezeigt32,41,47,48. Um zu bestätigen, dass dParg die zellulären PARylierungsniveaus während einer DNA-Schädigung reguliert, haben wir S2R+-Zellen mit dem PARG-Inhibitor PDD00017273 (PARGi)49 behandelt. Im Vergleich zu Kontrollzellen, die mit Dimethylsulfoxid (DMSO) als Negativkontrolle behandelt wurden, zeigten PARGi-behandelte S2R+-Zellen im nicht stimulierten Zustand höhere Mengen an PARylierten Proteinen (Abb. 2C). Wir haben auch bestätigt, dass die PARylierung in PARGi-behandelten S2R+-Zellen nach einer DNA-Schädigung induziert wurde (Abb. 2C). Im Gegensatz dazu stellten wir unter nicht stimulierten Bedingungen nur vernachlässigbare Unterschiede im Pan-ADPr (Kombination aus MAR- und PARylierung) zwischen DMSO- und PARGi-behandelten S2R+-Zellen fest (Abb. 2C). Wir beobachteten jedoch, dass ADPr in PARGi-behandelten S2R+-Zellen bei DNA-Schädigung im Vergleich zu DMSO-behandelten S2R+-Zellen dramatisch stimuliert wurde (Abb. 2C). Diese Daten legen nahe, dass das gegen menschliches PARG (hPARG) entwickelte PARGi die dParg-Aktivität effizient hemmte, wodurch der Abbau von ADPr in Drosophila blockiert und die Anreicherung von ADPr-Stellen ermöglicht wurde.

Als nächstes wollten wir durch massenspektrometrische Analyse die spezifischen Proteine ​​identifizieren, die in Drosophila S2R+-Zellen ADP-ribosyliert sind. Zu diesem Zweck verwendeten wir den bewährten Af1521-Anreicherungsansatz50,51,52 und analysierten Proteinextrakte aus DMSO- und PARGi-behandelten S2R+-Zellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von DNA-Schäden (Abb. 3A). Insgesamt haben wir mit Sicherheit 514 ADPr-Stellen identifiziert (Lokalisierungswahrscheinlichkeit > 0,9), was 296 ADPr-Zielproteinen in Drosophila S2R+-Zellen entspricht (Abb. 3B, C und ergänzende Daten 2). Erfreulicherweise zeigten die Daten eine gute Lokalisierungswahrscheinlichkeit, wobei > 75 % der ADPr-Peptidspektrum-Übereinstimmungen (PSMs) eine Lokalisierungswahrscheinlichkeit von > 90 % aufwiesen (ergänzende Abbildung 2A). Insgesamt beobachteten wir einen hohen Grad an Reproduzierbarkeit zwischen unseren experimentellen Replikaten, wobei die größte Variation bei den mit H2O2 behandelten Proben auftrat (Abb. 3C, D und ergänzende Abb. 2B).

Ein experimenteller Überblick. S2R+-Zellkulturen wurden mit DMSO oder 2 μM PARGi (PDD00017273) unter Kontrollbedingungen oder DNA-Schadensbedingungen (H2O2) in vierfacher Ausfertigung behandelt. Lysate wurden in Lösung verdaut und ADPr-modifizierte Peptide wurden mit selbst hergestelltem GST-markiertem Af1521 angereichert. ADPr-Proben wurden auf einem Thermo Orbitrap Fusion Lumos mittels EThcD-basierter Fragmentierung analysiert. Die Abbildung wurde teilweise mit Servier Medical Art erstellt, bereitgestellt von Servier, lizenziert unter einer Creative Commons Attribution 3.0 Unported-Lizenz. B Histogramm, das die Gesamtzahl der identifizierten und lokalisierten ADPr-modifizierten Stellen und Proteine ​​zeigt. C-Venn-Diagramme, die die Verteilung einzigartiger ADP-ribosylierter Peptide darstellen, die über die vier verschiedenen Ansätze identifiziert wurden. D Durchschnittliche Pearson-Korrelation der identifizierten ADPr-Stellen aus den vier Bedingungen. Dargestellt sind Mittelwerte von n = 6 ±SD. E Übersicht über die Anzahl der identifizierten und lokalisierten ADPr-Standorte. n = 4 Zellkulturreplikate, Daten werden als Mittelwerte ± SEM dargestellt. (F) Wie (D), zeigt die ADPr-Intensität. Jede Zellkulturbedingung wurde in vierfacher Ausfertigung hergestellt und die Daten werden als Mittelwerte ± SEM dargestellt. G-skaliertes Venn-Diagramm, das die Überlappung zwischen ADPr-Stellen darstellt, die unter DMSO- und PARGi-Bedingungen identifiziert wurden, beide nach H2O2-Behandlung. H STRING-Netzwerk visualisiert funktionelle Wechselwirkungen zwischen Proteinen mit ADPr-Stellen, die speziell unter PARGi-behandelten Bedingungen gefunden werden. Der minimal erforderliche Interaktionswert wurde auf hohes Vertrauen (0,7) festgelegt und nicht verbundene Proteine ​​wurden aus dem Netzwerk weggelassen. Proteine ​​wurden mit Farben versehen, wie in der Abbildungslegende hervorgehoben.

Wir identifizierten die höchste Anzahl an ADPr-Stellen in mit H2O2 behandelten PARGi-Proben (insgesamt 483), gefolgt von mit H2O2 behandelten DMSO-Proben (insgesamt 362, ergänzende Abbildung 2C). Insgesamt führte die DNA-Schädigung zum größten Unterschied im ADP-Ribosylom (ergänzende Abbildung 2D), und im Durchschnitt stellten wir den höchsten Anstieg der Anzahl der ADPr-Stellen fest, wenn wir mit DMSO behandelte Zellen, die einer DNA-Schädigung ausgesetzt waren, mit denen ohne Schädigung verglichen DMSO-behandelte Zellen, wobei bei H2O2-Behandlung etwa sechsmal mehr Stellen erkannt wurden (Abb. 3E). Der gleiche Trend wurde bei PARGi-behandelten Zellen beobachtet, wobei bei der H2O2-Behandlung etwa fünfmal mehr Stellen erkannt wurden. Dieser Anstieg der Anzahl der ADPr-Stellen bei DNA-Schäden war für die Intensität ADPr-modifizierter Peptide noch deutlicher (Abb. 3F). Hier beobachteten wir im Durchschnitt eine etwa 29-mal bzw. etwa 30-mal höhere ADPr-Intensität für H2O2-behandelte DMSO-Proben bzw. PARGi-Proben. Bei durch DNA-Schäden verursachten Proben führte die Zugabe von PARGi zu einer etwa zweifach höheren Intensität im Vergleich zur DMSO-Bedingung. Bei der Induktion von DNA-Schäden war die Überlappung zwischen DMSO-behandelten und PARGi-behandelten Zellen hoch (66 %), wohingegen ~29 % der Stellen spezifisch für PARGi-behandelte Proben waren (Abb. 3G). Bei der letztgenannten Fraktion handelt es sich höchstwahrscheinlich um Stellen mit physiologisch geringer Häufigkeit oder schnellem Umsatz, die durch PARGi-Behandlung stabilisiert wurden. Die für PARGi-behandelten Proben unter DNA-Schadensbedingungen spezifischen Stellen wurden mit Proteinen angereichert, die an der RNA-Verarbeitung, der Chromosomenorganisation und dem Ribosom beteiligt sind (Abb. 3H). Statistisch signifikante Änderungen beschränkten sich jedoch auf fünf Stellen, die nach PARGi-Behandlung hochreguliert wurden, und eine Stelle, die in DMSO-behandelten Proben hochreguliert wurde (ergänzende Abbildung 2E).

Wie in menschlichen Zellen beobachtet11,12,14,50, lokalisierten sich praktisch alle in dieser Studie identifizierten ADPr-Akzeptorstellen unter diesen Versuchsbedingungen auf Serinresten (Abb. 4A und ergänzende Daten 2), was zeigt, dass Ser-ADPr die Hauptform von ist ADPr in der Drosophila DDR, wie beim Menschen beobachtet. Angesichts der Tatsache, dass unsere vorherige Untersuchung des Af1521-Anreicherungsansatzes keine Voreingenommenheit gegenüber bestimmten Protein-ADP-Ribose-Verknüpfungen ergeben hat, schlagen wir vor, dass bei einer Modifikation anderer Aminosäurereste in Drosophila deren Häufigkeit unter der Nachweisgrenze liegen könnte. Wir fanden heraus, dass sich die meisten ADP-ribosylierten Serinreste (69,4 %) im Lysin-Serin (KS)-Motiv befanden, wie es beim Menschen vorkommt 13,51, was darauf hindeutet, dass der Targeting-Konsens von Ser-ADPr evolutionär konserviert ist (Abb. 4B und ergänzende Daten 2). ). In ähnlicher Weise handelt es sich bei den Ser-ADPr-Zielen hauptsächlich um Kernproteine, die mit der Aufrechterhaltung der Genomstabilität und der Chromatinstruktur verbunden sind (Abb. 4C).

Ein Kreisdiagramm, das die Verteilung von ADPr-modifizierten Aminosäureresten visualisiert. B IceLogo-Analyse, die den Sequenzkontext rund um identifizierte Serin-ADPr-Stellen (hellblauer Stern) zeigt, wobei Aminosäurereste oberhalb der Linie angereichert sind. Als Referenz wurden Sequenzfenster aller Serinreste in ADPr-Zielproteinen verwendet. C-Gen-Ontologie-Analyse, die die Anreicherung aller Ser-ADPr-Zielproteine ​​im Vergleich zum Gesamtgenom visualisiert. CC-Zellenfach; BP Biologisches Verfahren; MF Molekulare Funktion. D Histogramm, das die Gesamtintensität der ADPr-Stellen, die ADPr-Intensität von Histonen und die ADPr-Intensität von Histon H1A Ser199 zeigt. E Tabelle zum Vergleich der in Drosophila identifizierten ADPr-Stellen mit den beim Menschen identifizierten ADPr-Stellen. F dParp-Automodifikationsanalyse, die die relative Modifikationshäufigkeit basierend auf der MS/MS-Intensität zeigt. n = 4 Zellkulturreplikate, Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. G Mehrfachsequenz-Alignment ausgewählter PARP-Automodifikationsdomänensequenzen von Insekten und Säugetieren. In dParp und hPARP1 identifizierte Ser-ADPr-Stellen sind oberhalb der Ausrichtung durch das Doppeldolch-Symbol (‡) bzw. das Koppa-Symbol (ϟ) gekennzeichnet. Die Indizierung gibt die Position des dParp-Rests an. Die erweiterte Insektenausrichtung ist in der ergänzenden Abbildung 2 und die Sequenzen in der ergänzenden Tabelle 1 dargestellt.

In menschlichen Zelllinien wurde gezeigt, dass Histone ein Hauptziel von ADPr50,53 sind, und wir bestätigen, dass dies auch bei Drosophila der Fall ist (Abb. 4D). Insbesondere fanden wir heraus, dass Drosophila-Histon H1 eines der am stärksten ADP-ribosylierten Proteine ​​ist, mit Modifikationen an mehreren Stellen und Ser199, das als der am häufigsten modifizierte Rest identifiziert wurde (Abb. 4D, ergänzende Abb. 3A und ergänzende Daten 2). Während keine der Histon-H1-ADPr-Stellen mit den Stellen auf menschlichem Histon H1 identisch ist, sind eine Reihe anderer Drosophila-Ser-ADPr-Stellen in anderen Proteinen mit denen in ihren menschlichen Homologen identisch. Hier haben wir beispielsweise ADPr auf Ser10 und Ser28 auf Drosophila-Histon H3 beobachtet, die gemäß früheren Beobachtungen auch auf menschlichem Histon H3 modifiziert sind11,12,14,19,50. Während S10-ADPr in Drosophila unter physiologischen Bedingungen beobachtet wurde, wurde ADPr auf Ser28 nur bei DNA-Schäden beobachtet. Drosophila DNAlig1 wurde an Ser4 ADP-ribosyliert, was auch in menschlichem Lig111,12 zu sehen ist. Ein weiteres Beispiel war Drosophila BLM, das an Ser1424 ADP-ribosyliert wurde, was dem menschlichen Ser1342 entspricht (Abb. 4E)12.

Zusätzlich zu diesen trans-Zielen wurde dParp an vier Serinresten (Ser362, Ser491, Ser494 und Ser496) auto-ADP-ribosyliert, wobei die Intensität dieser Modifikationsstellen dem globalen Trend für Gesamt-ADPr im Hinblick auf PARGi- und H2O2-Behandlungen folgte ( Ergänzende Abbildung 3B–E und ergänzende Daten 2). Der relative Anteil der ADPr-Intensität variierte jedoch zwischen den verschiedenen Bedingungen, wobei Ser494 unter Kontrollbedingungen am stärksten verändert wurde und Ser491 bei DNA-Schäden (Abb. 4F). Die beobachtete Automodifikation von dParp wurde in einer Region lokalisiert, die der zuvor beschriebenen Automodifikationsdomäne von menschlichem PARP1 (hPARP1; aa 373–527) entspricht und die Hauptakzeptorstellen Ser499, Ser507 und Ser51911,30,50 enthält. Unter den vier dParp-Automodifikationsstellen sind Ser491 und Ser496 absolut, Ser494 teilweise (75 %, 27 von 36 ausgewählten Insektenarten) und Ser362 in Insekten nicht konserviert (Ergänzende Abbildung 4 und Ergänzende Daten 1). Darüber hinaus bleibt der Sequenzkontext der PARP1-Automodifikationsstellen von Säugetieren und Insekten innerhalb, jedoch nicht über ihre jeweiligen phylogenetischen Klassen hinweg erhalten. Es fällt auf, dass die Positionierung der Hauptautomodifikationsstellen relativ zu den anderen PARP1-Domänen/-Regionen stark konserviert ist (Abb. 4G). Dies legt nahe, dass die potenzielle Rolle der PARP1-Automodifikation bei der Regulierung seiner Rekrutierung und Freisetzung an Stellen mit DNA-Schäden auf der relativen Positionierung innerhalb der Struktur und nicht auf dem genauen Aminosäurekontext beruht. Dies wird weiter durch die Art der PARP1-Automodifikation gestützt, die aus verlängerten und verzweigten ADP-Ribose-Ketten besteht, die möglicherweise die Erkennung des Sequenzkontexts verhindern.

Während die meisten der identifizierten Ser-ADPr-Proteinziele zwischen Menschen und Drosophila gemeinsam waren, identifizierten wir auch 25 Drosophila-spezifische Ser-ADPr-Ziele (darunter elf Proteine ​​mit unbekannter Funktion). Die Genontologieanalyse zeigt eine starke Anreicherung zellulärer Komponenten, die mit Chromosomen wie der heterochromatischen Region und dem Polytänchromosom assoziiert sind (Abb. 4C). Beispielsweise zeigte ADPr auf Ser21 von D1, einem chromosomalen Multi-AT-Hook-Protein, die zweithöchste Intensität unter den Gesamtproteinen, während Drosophila HP5, das als HP1-Interaktor identifiziert wurde, sechs Ser-ADPr-Modifikationsstellen aufwies (Ser98, Ser101, Ser211, Ser249, Ser347 und Ser399).

Interessanterweise verdoppelte die PARGi-Behandlung die Häufigkeit von Ser-ADPr-Stellen, was darauf hindeutet, dass dParg möglicherweise für die Entfernung von Mono-Ser-ADPr in Drosophila verantwortlich ist (Abb. 4E). Um dies zu bestätigen, haben wir zunächst festgestellt, dass dParg an Stellen mit laserinduzierten DNA-Schäden rekrutiert (ergänzende Abbildung 1B). Anschließend untersuchten wir das ADPr-Muster von S2R+-Zellen, die entweder einem durch doppelsträngige RNA (dsRNA) vermittelten Abbau des dParg-Gens oder des LacZ-Gens (als Kontrolle verwendet) vor und nach der Exposition gegenüber H2O2 unterzogen wurden (Abb. 5). Zwei verschiedene dsRNAs, die unterschiedlichen Teilen der kodierenden DNA-Sequenzen der dParg-Gene entsprechen (Abb. 5A), wurden verwendet, um zu bestätigen, dass die Effekte spezifisch für die dParg-Depletion waren (Abb. 5B). Als nächstes analysierten wir die Produkte von PARP-vermitteltem ADPr vor und nach der H2O2-Behandlung durch Immunoblot von Ganzzellextrakten. Interessanterweise waren die Protein-Mono-ADPr-Spiegel in beiden dParg-Knockdown-Zelllinien vor und nach der DNA-Schädigung erhöht (Abb. 5C–E), während die Polymerspiegel erst nach H2O2-Exposition anstiegen (Abb. 5E, F). Dies legt nahe, dass dParg terminale Bindungen in vivo spalten kann, und weist zusammen mit unseren ADP-Ribosylomics-Daten darauf hin, dass Serinreste Ziele für durch reversible DNA-Schäden induziertes ADPr sind.

Eine schematische Struktur der Genomregion des dParg-Gens. Weiße Kästchen und graue Kästchen zeigen die nicht translatierte Region bzw. die kodierende Region des dParg-Gens. Schwarze Überstriche zeigen Regionen, auf die PARG-dsRNAs abzielen. B Die relative Genexpressionsanalyse des dParg-Gens in S2R+-Zellen, bestimmt durch RT-qPCR und normalisiert unter Verwendung des RpL39-Gens als interne Kontrolle. Fehlerbalken geben die durchschnittliche SD aus drei unabhängigen Replikaten an. Sternchen geben die statistische Signifikanz im Vergleich zur Kontrolle an, bestimmt durch t-Test (****p < 0,0001, zweiseitiger P-Wert, PARG-1 vs. LacZ, p = 6,9 × 10−8, PARG-2 vs. LacZ , p = 6,3 × 10−8). Drosophila S2R+-Zellen wurden mit 2 mM H2O2 behandelt und zu den angegebenen Zeitpunkten analysiert. C–F-Proteine ​​aus Ganzzelllysaten wurden durch SDS-PAGE getrennt und dann durch Immunblot unter Verwendung von Mono-ADPr- (MAR-Antikörper AbD33204, C Mono-ADPr- (MAR-Nachweisreagenz MABE1076, D pan-ADPr- (sowohl PAR als auch MAR-Nachweisreagenz, MABE1016. (E) und Poly-ADPr- (Antikörper 4336-BPC-100. F Bindungsreagenz. Ponceau S-Färbung und Aktin wurden als Ladekontrolle verwendet. Die Markierungen „PARP“ und „Histone“ neben dem Die Abbildungen geben die ungefähren Größen an, in denen diese Proteine ​​gefunden werden können. Diese Experimente wurden unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Als nächstes entschieden wir uns, Ser-ADPr in vitro mithilfe von Drosophila-Proteinen zu rekonstituieren. Zunächst haben wir gezeigt, dass der rekombinante dParp1:dHpf1-Komplex den Histon-H3-Schwanz in vitro effizient ADP-ribosylieren kann, wie zuvor für rekombinantes hPARP1:hHPF1 gezeigt (Abb. 6A)11,15,18. Um die Art der Modifikation zu bestätigen, haben wir das modifizierte Peptid gereinigt und mit zwei menschlichen (ADP-Ribosyl)hydrolasen, hTARG1 und hARH3, inkubiert, die spezifisch für Glu/Asp- bzw. Ser-gebundenes ADPr sind21,25,54. Hier konnten wir zeigen, dass hARH3 ADPr effizient aus dem Histon-H3-Peptid entfernte, hTARG1 hingegen nicht, was stark darauf hindeutet, dass es sich bei der Modifikation tatsächlich um Ser-ADPr handelt (Abb. 6B).

Ein Mono-Ser-ADPr des H3-Histonpeptids (AS 1–21) wurde durch Inkubation mit rekombinantem hPARP1:hHPF1-Komplex oder rekombinantem dPARP1:dHPF1-Komplex unter Verwendung von 32P-NAD+ als ADP-Ribose-Donor erhalten. PARP-Reaktionen wurden durch die Zugabe von Olaparib gestoppt. Das Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. B ADP-ribosylierte Histon-H3-Peptide aus (A) wurden aus der Reaktion gereinigt und mit rekombinantem hARH3 behandelt, um das Vorhandensein von Ser-ADPr zu bestätigen. Das Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Wie bereits erwähnt, fehlen Drosophila-Arten ARH3-Orthologe und daher muss die Spaltung der (ADP-Ribosyl)-Seryl-Bindung durch ein anderes Enzym durchgeführt werden. Das Fortbestehen des ADP-Ribosylierungssignals in unseren Experimenten mit PARGi in S2R+-Zellen legt nahe, dass dParg am DNA-Schadens-abhängigen ADPr-Signalumsatz beteiligt ist (Abb. 2B, C, 3 und 4). Neben dParg exprimiert Drosophila drei hTARG1-Homologe (CG33054/dTarg1, CG33056/dTarg2 und CG34261/dTarg355), deren potenzieller Beitrag zur Ser-ADPr-Entfernung nicht ausgeschlossen werden kann. Um die Substratspezifität dieser Enzyme zu beurteilen, führten wir (ADP-Ribosyl) Hydrolase-Assays mit verschiedenen Modellsubstraten durch, wobei wir die charakterisierten menschlichen Hydrolasen hPARG, hARH3 und hTARG1 als Kontrollen verwendeten (Abb. 7 und ergänzende Abb. 5). Insbesondere nutzten wir die zuvor festgestellte Fähigkeit von hPARP1 WT, Serin-15,18- und Glutamat-5,56-verknüpftes Poly-ADPr in Gegenwart bzw. Abwesenheit von hHPF1 zu erzeugen30. Ebenso haben wir die Mono-ADPr-Varianten mithilfe der hPARP1-E988Q-Mutante generiert, bei der es sich um eine spezifische Mono-(ADP-Ribosyl)transferase57 handelt. Sowohl hPARG als auch dParg entfernten leicht ADP-Ribose-Polymere, wohingegen der Umsatz durch hARH3 weniger ausgeprägt ist (Abb. 6A und ergänzende Abb. 5A), waren jedoch nicht in der Lage, die terminale Glutamat-ADPr-Bindung effizient zu entfernen (ergänzende Abb. 5A, B). . Während dParg und hARH3 darüber hinaus die Fähigkeit zeigten, Mono-Ser-ADPr aus Peptiden und automodifiziertem hPARP zu entfernen, wurde dies für hPARG und die Drosophila-TARG-Orthologe nicht beobachtet (Abb. 7).

A Entfernung von Poly-Ser-ADPr auf automodifiziertem hPARP1 in Gegenwart von hHPF1 und Poly-Ser-ADP-ribosyliertem Histon-H3/H4-Tetramer durch menschliche und Drosophila-(ADP-Ribosyl)hydrolasen. Die Reaktion wurde wie in Abb. 5A durchgeführt, außer dass Histon-H3/H4-Tetramer anstelle des Histon-H3-Peptids verwendet wurde. Das untere Feld zeigt CBB-gefärbte SDS-PAGE der Proteine. Das Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. B Entfernung von Poly-ADPr auf automodifiziertem hPARP1 (0,5 μM) in Gegenwart von hHPF1 (0,5 μM) und mono-Ser-ADP-ribosyliertem H3-Peptid (aa 1–21, 0,5 μg) durch Menschen und Drosophila (ADP-Ribosyl). )Hydrolasen. Die Reaktionen wurden wie in Abb. 5A beschrieben durchgeführt. Das untere Feld zeigt die CBB-gefärbte SDS-PAGE der Proteine. Das Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. C Entfernung von Mono-Ser-ADPr auf mono-Ser-ADP-ribosyliertem Histon-H3-Peptid (AS 1–21) durch menschliche und Drosophila-(ADP-Ribosyl)hydrolasen. Die Reaktionen wurden wie in Abb. 1A beschrieben durchgeführt und das Peptid wie in Abb. 1B beschrieben gereinigt. Das untere Feld zeigt CBB-gefärbte SDS-PAGE der Proteine. Das Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. D Messungen der Hydrolaseaktivität der angegebenen Hydrolasen gegen das synthetische Histon-H2B-Peptid Mono-Ser-ADPr auf S7 unter Verwendung des AMP-Glo-Assays (Promega). Die Proben werden hintergrundkorrigiert und auf hARH3 normalisiert. Die Daten stellen Dreifachmessungen von drei unabhängigen Experimenten ± SEM dar.

Bei Verwendung von Serin-PARyliertem Histon-H3.1/H4-Tetramer als Substrat13 beobachteten wir sowohl Poly-Ser- als auch Mono-Ser-ADP-ribosyliertes hPARP1, was es uns ermöglichte, die Aktivität aller getesteten (ADP-Ribosyl)hydrolasen separat zu bewerten Poly-Ser- und Mono-Ser-ADPr (Abb. 7A). Der Assay zeigt deutlich, dass dParg ADPr sowohl aus poly-Ser- als auch aus mono-Ser-ADP-ribosyliertem hPARP1 und Histone effizient umkehrt. Umgekehrt entfernte hPARG nur PAR aus hPARP1 und Histonen, während hARH3 Mono-Ser-ADPr effizient aus hPARP1 entfernte, aber schlecht auf PAR einwirkte und keine Aktivität gegen die modifizierten Histone zeigte. Um die Fähigkeit von hARH3 und dParg, Mono-Ser-ADPr zu entfernen, zu vergleichen, führten wir eine Hydrolase-Reaktion unter Verwendung eines synthetischen Histon-H2B-Peptids durch, gefolgt von der Umwandlung der freigesetzten ADP-Ribose in AMP durch menschliches NudT5 und der Lumineszenzdetektion mit dem kommerziellen AMP- Glo-Assay (Promega; Abb. 7D)58,59,60. Mono-Ser-ADPr wird sowohl durch hARH3 als auch durch dParg hydrolysiert, wobei hARH3 jedoch effizienter wirkt. Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass die vollständige Ser-ADPr-Umkehr in Drosophila nur auf einem einzigen Enzym (dParg) beruht, im Gegensatz zum menschlichen System, das zwei Enzyme (hPARG und hARH3) benötigt. Darüber hinaus lässt der Unterschied in der Mono-Ser-ADPr-Hydrolyseaktivität von hARH3 und dParg darauf schließen, dass die Aufrechterhaltung beider katalytischer Funktionen – Mono-Ser-ADPr- und PAR-Hydrolyse – innerhalb eines einzelnen Proteins (PARG) mit Effizienzkosten verbunden sein kann.

Um die unerwartete Fähigkeit von dParg zu untersuchen, sowohl PAR-Ketten als auch Mono-Ser-ADPr zu entfernen, verglichen wir seine Domänenarchitektur mit hPARG (Abb. 8A). Während beide Enzyme ein konserviertes akzessorisches und katalytisches Makrodomänenmotiv gemeinsam haben, das in hPARG für den PAR-Abbau verantwortlich ist, fehlt dParg die N-terminale Region von hPARG und besitzt eine zusätzliche C-terminale Domäne (Abb. 8A). Daher untersuchten wir, ob diese Domäne für die Hydrolyse der Serin-Ribose-Bindung verantwortlich sein könnte. Um diese Hypothese zu testen, haben wir drei Verkürzungen der C-terminalen dParg-Domäne generiert und die Fähigkeit dieser Varianten bewertet, die hPARP1-Auto-PARylierung (Abb. 8B) und Histon-H3-Mono-Ser-ADPr (Abb. 8C) zu entfernen. Die drei Kürzungen zeigten, dass dParg Δ554–723 seine Aktivität gegenüber PAR und Mono-Ser-ADPr verlor, wahrscheinlich aufgrund des Beitrags der C-terminalen Domäne zur strukturellen Integrität des Enzyms, während dParg Δ558–723 und dParg Δ574–723 erhalten blieben die Fähigkeit, sowohl PAR als auch Mono-Ser-ADPr zu entfernen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die C-terminale Verlängerung von dParg nicht für seine spezifische Ser-ADPr-Aktivität verantwortlich ist und legen nahe, dass das konservierte aktive Zentrum sowohl für die PAR- als auch für die Ser-ADPr-Entfernungsaktivität verantwortlich sein muss.

Eine schematische Darstellung der PARG-Domänenarchitektur. Die katalytische Domäne besteht aus zwei Unterdomänen; eine akzessorische Domäne (AD, gelb) und eine Makrodomäne (Makro, rot). Die Domänengrenzen sind unten angegeben und das katalytische EE-Motiv (schwarze Linie) über dem Diagramm. Abkürzung C. elegans PARG1, cPARG1; D. melanogaster Parg, dParg; Homo sapiens PARG, hPARG; Tetrahymena thermophila Parg, tParg. B Aktivität von katalytischen dParg-Mutanten und C-terminalen Verkürzungen auf Poly-Glu-automodifiziertem hPARP1. Poly-Glu-automodifiziertes hPARP1 wurde wie in Abb. 6C beschrieben erhalten und anschließend mit dParg WT oder den angegebenen Mutanten ergänzt. Das Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. C-Aktivität von katalytischen dParg-Mutanten und C-terminalen Verkürzungen auf gereinigtem mono-Ser-ADP-ribosyliertem Histon-H3-Peptid (aa 1–21). Mono-Ser-ADP-ribosyliertes Histon-H3-Peptid (aa 1–21) wurde wie in „Methoden“ beschrieben erhalten und anschließend mit dParg WT oder den angegebenen Mutanten ergänzt. Das Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Bei der vorherigen Charakterisierung von PARGs wurde eine katalytische Schleife identifiziert, die zwei absolut konservierte Reste (Glu755 und Glu756 beim Menschen) enthält, die für die Entfernung von PAR-Ketten entscheidend sind (Abb. 8A, B und ergänzende Abb. 6)24. Wir haben die entsprechenden dParg-Reste (Glu340 und Glu341) sowohl zu Aspartat als auch zu Alanin mutiert, um zu beurteilen, ob diese Mutanten ihre Fähigkeit zur Entfernung von Mono-Ser-ADPr behalten würden. Zuerst haben wir sowohl WT als auch mutiertes dParg gegen automodifiziertes hPARP1 bewertet (Abb. 8B). Wie erwartet hoben diese Mutationen die dParg-Aktivität gegen PAR auf. Ebenso konnten wir keine dParg-Aktivität gegen mono-Ser-ADP-ribosyliertes Histon H3 nachweisen (Abb. 8C). Diese Daten zeigen deutlich, dass diese Mutationen die dParg-Aktivität aufheben, was die Annahme stützt, dass dasselbe aktive Zentrum sowohl für die Entfernung von PAR als auch von Mono-Ser-ADPr verantwortlich ist, und lässt die Frage offen, wie dParg Mono-Ser-ADPr entfernt.

Die Entdeckung, dass die katalytische Domäne von dParg eine Aktivität zur Ser-ADPr-Entfernung entwickelte, veranlasste uns zu untersuchen, ob PARG-Homologe aus anderen Organismen eine solche Aktivität aufweisen könnten. Wir haben die Aktivität von PARG-Homologen aus dem Ciliaten Tetrahymena thermophila (tParg) getestet. In Abwesenheit von HPF1 sind die WT-Varianten aller getesteten PARG in der Lage, Glutamat-gebundenes PAR aus automodifiziertem hPARP1 zu entfernen, hinterlassen jedoch eine einzelne Bande, die Mono-Glu-ADPr hPARP1 entspricht (Abb. 9A). Die Aktivität wurde in der katalytischen tParg E256Q-Mutante aufgehoben. Interessanterweise verhält sich tParg in Bezug auf die Entfernung von Mono-Ser-ADPr aus dem modifizierten H3-Peptid ähnlich wie dParg, und diese Aktivität ging in der katalytisch toten tParg-E256Q-Mutante verloren (Abb. 9B). Diese Tests bestätigten, dass die Entfernung von Mono-Ser-ADPr durch PARG-Enzyme nicht nur bei Drosophila auftritt, sondern vielmehr ein Mechanismus ist, den mindestens ein anderer ARH3-Stamm ohne ARH3 teilt (Abb. 1A).

A Aktivität des PARG-Homologs von T. thermophila gegen Poly-Glu-automodifiziertes hPARP1. Poly-Glu-automodifiziertes hPARP1 wurde wie in Abb. 6C beschrieben erhalten. Das Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. B Aktivität von tParg auf gereinigtem mono-Ser-ADP-ribosyliertem Histon-H3-Peptid (aa 1–21). Mono-Ser-ADP-ribosyliertes Histon-H3-Peptid (AS 1–21) wurde wie in den Methoden beschrieben erhalten. Das Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Um Einblicke in die Fähigkeit von dParg zur Entfernung von Ser-ADPr zu gewinnen, haben wir zwei Strukturen der katalytisch aktiven dParg Δ574–723-Verkürzung gelöst: Die Apo-Struktur wurde mit einer Auflösung von 2,47 Å gelöst (PBD 8ADK, Abb. 10A und ergänzende Daten 2). ) und die Cokristallstruktur mit PARGi mit einer Auflösung von 2,51 Å (PDB 8ADJ, ergänzende Abbildung 7 und ergänzende Daten 2). Beide Strukturen sind sehr ähnlich, wobei die Reste 26 bis 525 und 533–547 in der Elektronendichte deutlich sichtbar sind und eine RMSD von 0,139 Å über 369 ausgerichtete Cα aufweist. Die dParg-Struktur besteht aus einer zentralen Makrodomänenfalte, die die vorhergesagte Substratbindungsspalte sowie die katalytischen Reste beherbergt61,62. Die Makrodomäne wird um eine hochstrukturierte und konservierte akzessorische Domäne erweitert, sodass die Gesamtdomäne aus einem verdrehten, gemischten, zehnsträngigen β-Faltblatt besteht, das von zwei überwiegend α-helikalen Unterdomänen flankiert wird (Abb. 8A). Die Gesamtstruktur von dParg ähnelt anderen PARGs mit RMSDs von 0,586 Å über 381 ausgerichtetem Cα für Menschen (PDB 4B1G), 0,651 Å über 366 ausgerichtetem Cα für Maus (mPARG; PDB 4FC2) und 1,816 Å über 255 ausgerichtetem Cα für tParg (PDB 4EPP, Abb. 10B). In ähnlicher Weise ähnelt der dParg:PARGi-Komplex stark hPARG-Komplexen mit ähnlichen Inhibitoren (RMSDs von 0,514 Å über 374 ausgerichtetem Cα für den PDD00017262 [PBD 5LHB] und 0,491 Å über 369 ausgerichtetem Cα für den PDD00017299 [PDB 6HML]-Komplex). Die PARGi-Bindung überlappt mit der Adenosin-Koordinationsregion innerhalb der Substratbindungsspalte. Die Bindung ist eng koordiniert mit gestaffelten π-Stapelwechselwirkungen zwischen Tyr380/Phe485 und der 2,4-Chinazolindion-Einheit (ergänzende Abbildung 7) sowie polaren Wechselwirkungen mit der Hauptkette von Ile311, Phe485 (ergänzende Abbildung 7) und dem Seitenketten von Glu312, Gln339 und Phe485 (ergänzende Abbildung 7). Es ist interessant festzustellen, dass Phe902, das zu dParg Phe485 isostrukturell ist, im hPARG:ADPr-Komplex (PDB 4NA0) mit dem Adeninring stapelt, was eine Seitenkettenrotation von ~90° relativ zur Inhibitor-Stapelwechselwirkung erfordert. Dies zeigt, dass die Inhibitorbindung nicht nur um den Bindungsraum konkurriert, sondern auch wichtige Substratkontakte verändert.

Eine Ribbon-Oberflächendarstellung von apo dParg. Zur Hervorhebung des aktiven Zentrums ist das ADP-Ribose-Dimer (gelb) der ausgerichteten hPARG:ADP-Ribose-Dimer-Komplexstruktur angegeben. Für die Katalyse wichtige Strukturmerkmale werden hervorgehoben: Schleifen 1 und 2 der akzessorischen Domäne, AD-Schleife 1 und 2; Katalytischer Kreislauf, Kreislauf 1; Diphosphat-Bindungsschleife, Schleife 2; Tyrosin-Verschluss, Tyr-Schlaufe. B Banddarstellung der strukturellen Ausrichtung von PARG-Domänen der angegebenen Arten (Drosophila, rot; Mensch, gelb; Maus, orange; T. thermophile, weiß). Die katalytischen Reste (Glu340/Glu341 in dParg) sind schwarz hervorgehoben. C Band-Lakritze-Darstellung der Loop-1-AD-Loop-1-Interaktion von Drosophila-, Human- und T. thermophile-PARGs. Polare Wechselwirkungen werden als schwarze gepunktete Linien und an der Wechselwirkung beteiligte Wassermoleküle als rote Kugeln hervorgehoben.

Der Vergleich des dParg mit den hPARG- und mPARG-Strukturen von Säugetieren sowie den tParg-Strukturen von Protozoen zeigt eine nahezu identische Architektur des aktiven Zentrums (Abb. 9B). Die Position der katalytischen Schleife (Schleife 1) ist in den verglichenen Strukturen isostrukturell, während die Diphosphat-bindende Schleife (Schleife 2) bekanntermaßen bei der Substratbindung eine Konformationsumlagerung erfährt (Abb. 10B und ergänzende Abbildungen 7 und 8 sowie ergänzende Tabelle). 1)63,64. Schleife 2 scheint in der offenen Position zu kristallisieren und ähnelt stark der Apo-mPARG-Struktur (ergänzende Abbildung 8). In der mPARG:ADPr-Komplexstruktur (PDB 4NA0) bewegt sich die Schleife leicht in die Substratbindungsspalte, wodurch die Stickstoffatome der Hauptkette von Gly866 und Ala867 mit den Phosphatsauerstoffatomen der ADP-Ribose interagieren können. Die Substratbindung geht außerdem mit einer Neupositionierung von Phe868 (Phe458 in dParg) und His821 (His413 in dPARG) einher, die aus der Bindungsspalte verdrängt werden und zur Koordination der distalen Ribose beitragen (ergänzende Abbildung 7). Diese Ergebnisse legen nahe, dass es keine größeren strukturellen Unterschiede in der Koordination der ADP-Ribose-Einheit oder der Platzierung der katalytischen Reste gibt und weisen auf subtile Unterschiede zwischen PARGs hin, die die terminale Ser-ADPr-Bindung entfernen können, und solchen, die dies nicht können.

Schließlich untersuchten wir strukturelle Merkmale neben Schleife 1: Es wurden zwei Schleifen identifiziert, die sich innerhalb der akzessorischen Domäne befinden und sowohl die Positionierung von Schleife 1 als auch die Wechselwirkung zwischen akzessorischer Makrodomäne unterstützen (als AD-Schleife 1 und 2 bezeichnet; Abb. 10A, B und ergänzende Abb . 6). Die Wechselwirkung zwischen Schleife 1 und AD-Schleife 1 wird durch ein erweitertes Wassernetzwerk in hPARG stabilisiert (Abb. 10C). Allerdings sind diese Wechselwirkungen in dParg deutlich reduziert, während AD-Loop 1 in tParg fehlt (Abb. 10C). Der Hauptunterschied im Koordinationsnetzwerk zwischen Loop1 und AD-Loop 1 ist das Vorhandensein eines Threoninrests (Thr748 in hPARG), wohingegen sowohl dParg als auch tParg einen Leucinrest (Leu333 bzw. Leu248) in der isostrukturellen Position enthalten. Unsere phylogenetische Analyse zeigten, dass Threonin in Mammalia konserviert ist und Leucin in Diptera, Nematoda und Protozoa zu finden ist (ergänzende Abbildung 6), was darauf hindeutet, dass es tatsächlich ein Faktor für die Substratspezifität ist. Der Abstand vom katalytischen EE-Motiv beträgt jedoch sowie seine Ausrichtung vom Substrat weg (Abb. 10A) lassen auf keine direkte Beteiligung am katalytischen Mechanismus schließen.

Die Serin-gebundene ADP-Ribosylierung ist ein entscheidender Signalmechanismus in der DDR von Menschen und anderen Säugetierarten. Hier haben wir den Beweis erbracht, dass diese Signalvariante im gesamten Tierreich verbreitet ist und möglicherweise ein bestimmendes Merkmal der DDR-Regulierung dieses Königreichs ist. Mithilfe modernster Massenspektrometrie stellen wir einen ersten Entwurf des ADP-Ribosyloms von Drosophila zur Verfügung, der mehr als 500 hochsichere ADPr-Stellen identifiziert. Zuvor wurde berichtet, dass ADPr Asparaginsäure-, Glutaminsäure-, Lysin- und Argininreste modifiziert52,65,66. Die relativ neue Entdeckung von Serinresten als Akzeptorstellen13 hat zur Identifizierung von Serin als dem am häufigsten modifizierten Aminosäurerest unter DNA-Schäden in Zellkulturen geführt12,14. Durch die Kombination der Af1521-Anreicherungsstrategie, die in der Lage ist, ADPr an allen möglichen Aminosäureresten zu identifizieren50,67,68, mit der ETD-Fragmentierung zur korrekten Lokalisierung der Modifikationsstelle12 identifizierten wir Serin als den am häufigsten modifizierten Rest in Drosophila unter diesen experimentellen Bedingungen . Dennoch könnten die experimentellen Bedingungen sowie die Tiefe der Sequenzierung dazu führen, dass andere bekannte Aminosäureakzeptorreste fehlen. Unsere Analyse des Ser-ADPr-Zyklus in D. melanogaster ergab außerdem eine bemerkenswerte Konservierung des menschlichen Signalwegs. Auf molekularer Ebene ist nicht nur das Säugetier-ADPr-Konsensusmotiv „KS“ konserviert, sondern wir beobachten auch eine breite Überlappung mit zuvor identifizierten ADPr-Zielen beim Menschen. Dies gilt insbesondere für die wichtigsten ADP-Ribose-Akzeptoren wie PARP1 und Histone. Bei beiden Arten sind Signalwege, die für die Stabilität des Genoms, die Regulierung der Chromatinstruktur und die Transkription relevant sind, Hauptziele dieser Modifikation. Unsere Daten legen daher nahe, dass Drosophila als Modellorganismus dienen kann, um Einblicke in die physiologische Funktion der Ser-ADPr-Signalübertragung zu gewinnen. Dies beinhaltet die Möglichkeit, die Zusammenhänge zwischen dieser Veränderung und den damit verbundenen Krankheiten einschließlich Neurodegeneration und Krebs zu verstehen30,41,69,70,71. In diesem Zusammenhang wurde zuvor gezeigt, dass ein dParg-Mangel durch das menschliche ARH3-Gen kompensiert werden kann71. Da außerdem gezeigt wurde, dass die hPARP1-Automodifizierungsregion, die nachweislich für das Einfangen von hPARP1 an DNA-Brüchen und die PARP-Inhibitor-Reaktion beim Menschen wichtig ist, in Drosophila-Arten funktionell konserviert ist (Abb. 4G und ergänzende Abb. 4), könnte dieses Modell nützlich sein für Verständnis der physiologischen Wirkungen klinisch relevanter PARP-Inhibitoren30.

Unsere phylogenetische Analyse zeigt, dass ARH3 unter den HPF1-tragenden Arten in Protozoen, Nematoden, Lepidopteren und Dipteren fehlt. Im Gegensatz dazu kann ARH3 in den meisten Animalia identifiziert werden, einschließlich basaler Tiere aus den Phyla Placozoa, Porifera oder Cnidaria. Dieses Muster der Anwesenheit und Abwesenheit von ARH3 deutet stark auf eine Evolutionsgeschichte hin, die (i) einen Gewinn von ARH3 in der frühen Evolution von Animalia und (ii) mindestens zwei unabhängige Verlustereignisse beinhaltet: erstens bei der Spaltung zwischen Nematoda und Arthropoda und zweitens während der Diversifizierung innerhalb der Endopterygota-Überordnung. Interessanterweise fehlt PARP2, das beim Menschen auch Ser-ADPr erzeugen kann, auch in Drosphila. Daher scheint es, dass Drosophila trotz der Erhaltung der physiologischen Funktion nur ein minimales Ser-ADPr-System für die Regulierung der DDR nutzt, bestehend aus dHPf1, dParp als einzigem DNA-Reparatur-PARP (wenn auch mit hPARP1-Domänenarchitektur) sowie dParg, das sowohl Poly- als auch Mono-Ser-(ADP-Ribosyl)hydrolase-Aktivität kombiniert. Angesichts der funktionalen Ähnlichkeiten kann dies für einige Studien von Vorteil sein, da es eine einfachere Manipulation der Signalbildung und -entfernung ermöglicht. Darüber hinaus ergab unsere Studie, dass Werkzeuge, die für die Untersuchung und klinische Anwendung von menschlichem Ser-ADPr entwickelt wurden, wie ADPr-Nachweisreagenzien und -Antikörper sowie Inhibitoren, für die Untersuchung der ADPr-Signalübertragung in Drosophila eingesetzt werden können. Unsere Strukturdaten zeigten, dass das aktive Zentrum von dParg im Vergleich zu PARGs von Säugetieren und Protozoen konserviert ist, was darauf hindeutet, dass der Aktivitätsunterschied nicht auf einen veränderten katalytischen Mechanismus zurückzuführen ist. Insgesamt deuten unsere Daten darauf hin, dass die Fähigkeit zur Spaltung der Ser-ADPr-Bindung auf subtilen strukturellen Unterschieden rund um das aktive Zentrum beruht, die den Zugang bestimmter Substrate (verhindern) können. Diese Idee wird durch die Unterschiede in der Substratgeometrie weiter gestützt. Strukturdaten eines ADP-Ribose-Dimers im Komplex mit hPARG (PDB 5A7R) zeigen, dass sich die n-1-Einheit linear aus dem aktiven Zentrum erstreckt (Abb. 10A). Im Gegensatz dazu liegt das mit hARH3 kokristallisierte Serin-modifizierte Peptid (PDB 7AKS) senkrecht zur ADP-Ribose-Bindungstasche. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um die Art der Wechselwirkung verschiedener PARGs mit ihren verschiedenen Substraten zu ermitteln. Basierend auf unseren phylogenetischen und biochemischen Erkenntnissen ist es interessant zu spekulieren, dass die Fähigkeit von PARGs, die terminale Protein-Ribose-Bindung zu spalten, möglicherweise nicht auf Fruchtfliegen beschränkt ist. Dies wird gestützt durch (i) die Identifizierung mehrerer Evolutionszweige, die HPF1 tragen, denen aber ARH3 fehlt (Abb. 1), (ii) unsere experimentelle Bestätigung, dass tParg auch Ser-ADPr entfernen kann (Abb. 9) sowie (iii ) Aktuelle Beobachtungen an Pflanzen, die zeigen, dass Arabidopsis thaliana Parg1 Mono-ADPr aus SZF172 entfernen kann. Insbesondere wurden PARG-Genduplikationen sowohl in Pflanzen als auch in C. elegans73,74 beschrieben, was auf eine Diversifizierung bekannter ADPr-Signalsysteme hinweist, die neue Überraschungen für zukünftige Entdeckungen bereithalten könnte.

Die Drosophila S2R+-Zelllinie wurde bei DGRC (https://dgrc.bio.indiana.edu/Home) gekauft und in Drosophila Schneiders Medium (21720-024, Gibco) kultiviert, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (10500). -056, Gibco) und 1 % Penicillin-Streptomycin (100 U/ml, 15140-122, Gibco) bei 25 °C und alle 3–4 Tage passagiert. Die menschliche U2OS-Osteosarkom-Zelllinie wurde bei ATCC (HTB-96) gekauft und in DMEM (10566016, Gibco), ergänzt mit 10 % FBS (F9665, Sigma) und Penicillin-Streptomycin (100 U/ml, GIBCO), bei 37 °C gezüchtet C mit 5 % CO2 und alle 3–4 Tage passagiert. Für alle DNA-Schadensinduktionsexperimente wurden Zellen mit einer Dichte von 5 × 106 Zellen für S2R+-Zellen oder 2 × 106 Zellen für U2OS-Zellen in einer 6-cm-Schale ausgesät. Am nächsten Tag wurden die Zellen einmal sorgfältig mit PBS gewaschen und mit 2 mM H2O2 (H1009, Sigma) oder 5 mM MMS (129925, Sigma) in PBS plus Calcium und Magnesium (DPBS, Gibco, 14040-133) für die angegebenen Zeiten geschädigt. Zur Behandlung des PARG-Inhibitors wurden 5 × 106 Zellen in eine 6-cm-Schale ausgesät. Am nächsten Tag wurden die Zellen 16 Stunden lang mit 2 μM PARG-Inhibitor (PDD00017273, Sigma) behandelt, während Kontrollzellen mit DMSO behandelt wurden. Anschließend erfolgte die H2O2-Behandlung wie oben beschrieben.

Die Zellen wurden in 50 mM TrisHCl (pH 8,0), 100 mM NaCl und 1 % (Vol./Vol.) Triton Inhibitor (PDD00017273, Sigma) und 1 μM PARP-Inhibitor (Olaparib, LKT LABS). Die Lysate wurden mit 0,1 % Benzonase (Sigma) 30 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. Die lösliche Fraktion wurde mit NuPAGE LDS-Probenpuffer (Invitrogen) mit 50 mM DTT gemischt und die Proteine ​​5 Minuten lang bei 95 °C denaturiert. Die gesamten Zellextrakte aus S2R+-Zellen wurden elektrophoretisch auf NuPAGE Novex 4–12 % Bis-Tris-Gelen (Invitrogen) aufgetrennt und 30 Minuten lang mit dem Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad) auf Nitrozellulosemembranen (Bio-Rad) übertragen. Die geblotteten Membranen wurden mit PBS-Puffer, der 0,1 % (v/v) Tween 20 und 5 % (w/v) Magermilchpulver enthielt, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert und dann mit Kaninchen-Anti-Poly-ADPr-Antikörper (4336-BPC-) inkubiert. 100, Trevigen, 1:1.000, RRID: AB_2721257), Kaninchen-Anti-Poly-ADPr-Antireagenz (MABE1031, Millipore, 1:500, RRID: AB_2665467), Kaninchen-Anti-Pan-ADPr-Antireagenz (MABE1016, Millipore, 1:1.000, RRID: AB_2665466), Kaninchen-Anti-Mono-ADPr-Anti-Reagenz (MABE1076, Millipore, 1:500, RRID: AB_2665469), Kaninchen-Anti-Mono-ADPr-Antikörper (AbD33204, BioRad, 1:1.000), Kaninchen-Anti-Phosphor-Histon H2AvD (Ser137 ) Antikörper (600-401-914, Rockland, 1:3.000, RRID: AB_828383), Maus-Anti-Phosphor-Histon H2A.X (Ser139)-Antikörper (Klon JBW301, 05-636, Millipore, 1:500, RRID: AB_309864) oder monoklonale Maus-Anti-Actin-Antikörper (JLA20, Konzentration, Developmental Studies Hybridoma Bank, 1:10.000, RRID: AB_528068) bei 4 °C über Nacht. Nach dem Waschen mit PBS, das 0,1 % (v/v) Tween 20 enthielt, wurden die Blots mit einem Meerrettichperoxidase-markierten Anti-Kaninchen-IgG (P0399, Dako, 1:4.000, RRID: AB_2617141) oder Anti-Maus-IgG (P0447, Dako, 1:4.000, RRID: AB_2617137) für 1 Stunde. Der Nachweis wurde mit Pierce ECL Western Blot-Substrat (Thermo Scientific) durchgeführt und durch Luminographie mit Hyperfilm ECL (Amersham) analysiert. Die Experimente wurden für mindestens drei unabhängige Wiederholungen durchgeführt.

ADP-ribosylierte Peptide wurden wie zuvor beschrieben lysiert und angereichert. 12, 51, 75. Kurz gesagt, Zellpellets wurden in 10 Pelletvolumina Lysepuffer (6 M Guanidinhydrochlorid, 50 mM TrisHCl [pH 8,5]) lysiert und eine vollständige Lyse wurde durch abwechselndes kräftiges Schütteln und kräftiges Vortexen erreicht. Nach Reduktion und Alkylierung mit TCEP und CAA wurden die Proteine ​​3 Stunden lang mit Lysyl-Endopeptidase (Lys-C, 1:100 w/w; Wako Chemicals) verdaut und mit drei Volumina 50 mM Ammoniumbicarbonat verdünnt. Die Proben wurden über Nacht mit Trypsin in modifizierter Sequenzierungsqualität (1:100 w/w; Sigma Aldrich) weiter verdaut. Aufgeschlossene Proben wurden mit Umkehrphasen-C18-Kartuschen gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die Elution der Peptide erfolgte mit 30 % ACN in 0,1 % TFA, die Peptide wurden über Nacht bei –80 °C eingefroren und anschließend 96 Stunden lang lyophilisiert.

Lyophilisierte Peptide wurden in AP-Puffer (50 mM TrisHCl [pH 8,0], 1 mM MgCl2, 250 μM DTT und 50 mM NaCl) gelöst und für jedes Wiederholungsexperiment wurden etwa 2 mg Peptid verwendet. Die Proben wurden mit Af1521 inkubiert und 4 Stunden lang bei 4 °C kopfüber rotierend stehen gelassen. Die Perlen wurden zweimal in frisch zubereitetem eiskaltem AP-Puffer, zweimal in eiskaltem PBS mit DTT und zweimal in eiskaltem MQ-Wasser gewaschen, wobei bei jedem Pufferwechsel ein Röhrchenwechsel durchgeführt wurde. ADPr-modifizierte Peptide wurden durch Zugabe von eiskalter 0,15 % TFA von den Perlen eluiert. Eluierte Peptide wurden durch 0,45-μm-Spinfilter und anschließend durch vorgewaschene 100-kDa-Cut-off-Spinfilter (Vivacon 500, Satorius) geleitet, wonach sie bei hohem pH-Wert in drei Fraktionen und eine zusätzliche F012,50,51,53 fraktioniert wurden .

Alle MS-Experimente wurden auf einem EASY-nLC 1200 HPLC-System (Thermo) analysiert, das an ein Fusion Lumos Orbitrap-Massenspektrometer (Thermo) angeschlossen war. Jede Probe wurde auf einer 15 cm langen Analysesäule mit einem Innendurchmesser von 75 μm aufgetrennt, hausintern mit 1,9 μm großen C18-Perlen (ReproSil-Pur-AQ, Dr. Maisch) gepackt und mit einem Säulenofen auf 40 °C erhitzt . Die Peptidtrennung wurde unter Verwendung eines 60-minütigen Gradienten bei einer Flussrate von 250 nL/min durchgeführt, wobei Puffer A bestehend aus 0,1 % FA und Puffer B bestehend aus 80 % ACN in 0,1 % FA verwendet wurden. Das Massenspektrometer wurde im datenabhängigen Erfassungsmodus betrieben, wobei vollständige Scans mit einer Auflösung von 120.000 und einer maximalen Injektionszeit von 250 ms durchgeführt wurden. Die Vorläuferfragmentierung wurde durch Elektronentransferdissoziation mit zusätzlicher höherer Kollisionsdissoziation (EThcD) mit einer zusätzlichen Aktivierungsenergie von 20 erreicht. Vorläufer mit Ladungszustand 3–5 wurden einbezogen und von Ladung 3 (höchste) bis Ladung 5 (niedrigste) priorisiert der Entscheidungsbaumalgorithmus. Ausgewählte Vorläufer wurden von der wiederholten Sequenzierung ausgeschlossen, indem ein dynamischer Ausschluss von 45 s festgelegt wurde. MS/MS-Spektren wurden im Orbitrap mit einer maximalen Vorläuferinjektionszeit von 500 ms und einer Scanauflösung von 60.000 gemessen. Alle MS-Rohdaten wurden mit der MaxQuant-Software-Suite Version 1.5.3.3076 analysiert und anhand des Drosophila-Proteoms im FASTA-Dateiformat durchsucht, das am 11. November 2020 von UniProt heruntergeladen wurde. Es wurden die Standardeinstellungen von MaxQuant verwendet, mit Ausnahme der folgenden: Cystein-Carbamidomethylierung, und ADP-Ribosylierung an Cystein-, Asparaginsäure-, Glutaminsäure-, Histidin-, Lysin-, Arginin-, Serin-, Threonin- und Tyrosinresten wurden als variable Modifikationen einbezogen. Der Andromeda-Delta-Score wurde für modifizierte Peptide auf mindestens 20 festgelegt.

Die statistische Verarbeitung der Daten erfolgte hauptsächlich mit der frei verfügbaren Perseus-Software77 und umfasst eine Hauptkomponentenanalyse und eine Vulkanplotanalyse. Anmerkungen zur Protein-Gen-Ontologie wurden mit DAVID Bioinformatics Resources78 durchgeführt. Die Sequenzkontextanalyse wurde mit der IceLogo-Software79 durchgeführt.

Die RNA-Interferenzanalyse wurde wie zuvor in Lit. beschrieben durchgeführt. 80, 81. Die Nukleotide 34–367 der dParg-cDNA wurden mit SnapDragon (https://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl) als Ziele von dsPARG-1 ausgewählt. Die Ziele von dsPARG-2 (769-1275) und dsLacZ wurden wie zuvor in Lit. beschrieben hergestellt. 32. Oligonukleotide zur Generierung von Vorlagen für dsRNAs durch PCR sind in den ergänzenden Daten 3 angegeben. dsRNAs wurden mit dem MEGAscript T7-Kit (Thermo Fisher Scientific, AM1334) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Die RNA wurde 30 Minuten lang bei 65 °C denaturiert und dann durch langsames Abkühlen auf 4 °C angelagert. Pro 1 × 106 Zellen wurden 10 μg dsRNA hinzugefügt. Die Zellen wurden 5 Tage nach der dsRNA-Behandlung geerntet, gefolgt von der Induktion des DNA-Schadens mit H2O2 wie oben beschrieben oder einer Reverse-Transkriptase-Quantitative-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)-Analyse wie unten beschrieben.

Die Gesamt-RNAs aus S2R+-Zellen wurden mit dem RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) gereinigt und dann wurden 0,5 μg Gesamt-RNA für die cDNA-Synthese mit dem QuantiTect Reverse Transcription Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die cDNAs wurden durch quantitative Echtzeit-PCR mit dem Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit und dem Rotor-Gene Q (QIAGEN) nachgewiesen. Primerpaare für RT-qPCR sind in den Zusatzdaten 3 angegeben. Die relative Genexpressionsanalyse des dParg-Gens wurde unter Verwendung der ddCt-Methode durchgeführt.

Für die statistische Analyse wurde Prism 9.1 (GraphPad) verwendet, wobei ****p < 0,0001 war. Einzelheiten zu statistischen Analysen sind in der Legende zu Abb. 4 beschrieben.

Expressionsvektoren für hARH3, hTARG1, hHPF1, hPARP1 und hPARG wurden bereits früher beschrieben5,15,54,63. Die kodierende Sequenz von dParp, dParg, dTarg1-3 und dHpf1 wurde aus cDNA amplifiziert, die aus S2R+-Zellen unter Verwendung der in den ergänzenden Daten 3 aufgeführten Oligonukleotide hergestellt wurde, und in pET28a-Expressionsplasmide mit einem N-terminalen His-Tag kloniert. Alle angegebenen Mutationen wurden durch PCR-basierte ortsspezifische Mutagenese eingeführt (Supplementary Data 3). Die Expression erfolgte in E. coli Rosetta (DE3)-Zellen (Novagen) und Terrific Broth-Medien, ergänzt mit 30 μg/ml Kanamycin und 30 μg/ml Chloramphenicol. Die Zellen wurden bei 37 °C gezüchtet und das Wachstum gestoppt, als die Kultur eine OD600 ~ 0,6 erreichte. Anschließend wurden die Kulturen mit 1 mM IPTG induziert und über Nacht bei 18 °C inkubiert. Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei 3000 x g zentrifugiert und die Pellets in Puffer A (50 mM TrisHCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10 mM Imidazol), ergänzt mit 1× cOmplete EDTA-freiem Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche), resuspendiert ) und 250 U Benzonase-Nuklease (Sigma) pro 1 l Zellkultur. Alle folgenden Reinigungsschritte wurden bei 4 °C durchgeführt. Die Lyse wurde unter Verwendung eines Homogenisators durchgeführt und die Zelltrümmer wurden durch 60-minütige Zentrifugation bei 35.000 x g abgetrennt. Der Überstand wurde dann mit Ni-NTA-Harz (Qiagen), voräquilibriert mit Puffer A, 30 Minuten lang inkubiert. Die Suspension wurde in eine leere Schwerkraftflusssäule (BioRad) überführt und das Harz vor der Elution mit Puffer A, ergänzt mit 300 mM Imidazol, mit 10 Säulenvolumina Puffer A gewaschen. Eluierte Proteine ​​wurden über Nacht bei 4 °C gegen 25 mM TrisHCl (pH 8), 500 mM NaCl und 1 mM DTT dialysiert. Anschließend wurden die Proteine ​​konzentriert und einer Größenausschlusschromatographie unter Verwendung einer HiLoad 16/60 Superdex 75-Säule unterzogen, die mit 10 mM TrisHCl (pH 8), 100 mM NaCl, 0,2 mM TCEP für dParg und dTarg1-3 oder 10 mM TrisHCl ( pH 8), 100 mM NaCl, 0,1 mM TCEP für dTarg1-3 bzw. dHpf1. Eluiertes dParg und dTarg1-3 wurden auf 8 mg/ml und dHpf1 auf 9 mg/ml konzentriert. Die Proteinqualität wurde für jeden Schritt durch SDS-PAGE bewertet. Alle anderen Proteine ​​wurden wie zuvor beschrieben exprimiert und gereinigt: hPARG62, hHPF115, hPARP1-Wildtyp und die E988Q-Mutante82, hARH1, hARH2, hARH383 und Histon H3/H484. Das Histon-H3-Peptid (aa 1–21) wurde von Sigma (SaintLouis, MO, USA) gekauft.

ADPr wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt25. Kurz gesagt, rekombinante Proteine ​​oder Peptide wurden durch hPARP1 ADP-ribosyliert, um Glu-ADPr zu produzieren, oder durch hPARP1:hHPF1, um Ser-ADPr zu produzieren. Die Reaktionen wurden in 50 mM TrisHCl (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, aktivierter DNA und 50 µM NAD+, versetzt mit 32P-NAD+, durchgeführt. Die hPARP1-Reaktion wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur durchgeführt und durch Zugabe von 1 µM Olaparib gestoppt. ADP-ribosylierte Proteine ​​wurden als Substrat für die aufeinanderfolgenden (ADP-Ribosyl)hydrolase-Assays verwendet. Das Substrat wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit den angegebenen (ADP-Ribosyl)hydrolasen inkubiert und mittels SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Die Konzentrationen von hPARP1 und hHPF1 pro Reaktion betrugen 0,5 μM, (ADP-Ribosyl)hydrolase 1 μM, Histon-Tetramere H3/H4 2 μM und Histonpeptide 0,5 μg.

Der Test wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt58,59,60. Kurz gesagt wurde die Konzentration des synthetischen Mono-Ser-ADPr-H2B-Peptids59 unter Verwendung der Absorption bei λ260 nm mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 13.400 M−1 cm−1 für die ADP-Ribosylmodifikation geschätzt. 8 μM Peptid wurden durch 30-minütige Inkubation mit 1 μM angegebener Hydrolase bei 30 °C in Testpuffer (50 mM TrisHCl [pH 8], 200 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol und 0,2 μM menschliches NudT585) demodifiziert. Die Reaktionen wurden gestoppt und analysiert, indem der AMP-Glo™-Assay (Promega) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt wurde. Die Lumineszenz wurde mit einem SpectraMax M5-Plattenlesegerät (Molecular Devices) aufgezeichnet und die Daten mit GraphPad Prism 9.1 analysiert. Zur Hintergrundsubtraktion wurde die Reaktion in Abwesenheit von Hydrolase durchgeführt.

Das Histon-H3-Peptid wurde wie oben Ser-ADP-ribosyliert, mit der Ausnahme, dass höhere Substratkonzentrationen verwendet wurden. Ser-ADP-ribosylierte Peptide wurden durch Filtern der Reaktion unter Verwendung einer Konzentrationssäule mit einem Cut-off von 10 kDa (Millipore) weiter gereinigt. Überschüssiges NAD+ wurde mit einer G25-Spin-Säule (GE HealthCare, UK) entfernt.

Ausrichtungen von HPF1-Sequenzen von Metazoen- und Protozoenarten (Ergänzungsdaten 1) wurden mit JalView v. 2.1186 generiert und die HPF-Domäne aus ihrem sequentiellen Kontext basierend auf der Mafft L-INS-i-Ausrichtung extrahiert87 unter Verwendung kristallographischer Daten zur Bestimmung der Domänengrenzen. Extrahierte Sequenzen wurden mit dem Mafft L-INS-i-Algorithmus neu ausgerichtet. Die Evolutionsgeschichten der HPF-Domäne wurden unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Methode und des Le_Gascuel_2008-Modells88 mit einem automatisch erhaltenen Anfangsbaum für die heuristische Suche durch Anwendung der Maximum-Parsimony-Methode abgeleitet. Die Analyse wurde mit einer Site-Abdeckung von 95 % und der Option zur teilweisen Löschung durchgeführt. Die Konfidenzniveaus wurden anhand von 1000 Zyklen der Bootstrap-Methode geschätzt. Evolutionäre Analysen wurden in MEGA1189 durchgeführt.

Ausrichtungen von PARP- und PARG-Sequenzen (Ergänzungstabellen 1 und 3) wurden mit JalView v. 2.11 unter Verwendung des implementierten Mafft L-INS-i-Algorithmus generiert.

Kristallisationsversuche wurden bei 4 °C mit handelsüblichen Sieben unter Verwendung der Dampfdiffusionsmethode mit Hilfe eines Mosquito Crystal-Roboters (TTP Labtech) durchgeführt, wobei sitzende Tropfen einer 150-nl-Proteinlösung in mit 150 nl äquilibrierten MRC-Kristallisationsmikroplatten mit zwei Vertiefungen (Swissci) verwendet wurden Reservoir. Kristalle von dParg wurden in 19 % (Gew./Vol.) PEG3350, 210 mM Natriumsulfat, 0,1 M Bis-Tris-Propan (pH 7,2) gezüchtet. Kristalle von dParg im Komplex mit dem Inhibitor PDD00017273 wuchsen unter den gleichen Bedingungen, mit der Ausnahme, dass PDD00017273 vor der Kristallisation der Proteinlösung in einer Konzentration von 0,5 mM zugesetzt wurde. Alle Kristalle wurden in 15 % (v/v) Glycerin in der Mutterlauge kryogeschützt, bevor sie durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff vitrifiziert wurden. Die Datenerfassung erfolgte an den Strahllinien I04 und I24 der Diamond Light Source (Rutherford Appleton Laboratory, Harwell, UK).

Röntgendaten wurden mit Xia290 verarbeitet. PHASER91 wurde für molekulare Ersatzversuche mit hPARG (PDB: 6HMK) als molekularem Ersatzmodell verwendet. Die Dichtemodifikation wurde mit PARROT92 durchgeführt und erste Modelle wurden mit dem automatisierten Modellbauprogramm BUCCANEER93 erstellt. Der Modellaufbau für alle Strukturen wurde mit COOT94 und die Realraumverfeinerung mit REFMAC595 durchgeführt, gekoppelt mit automatisch generierten lokalen nichtkristallographischen Symmetriebeschränkungen und TLS-Verfeinerung. Statistiken für dParg und den dParg:PDD00017273-Komplex sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Drosophila S2R+-Zellen wurden auf einem ibiTreat-Kammerobjektträger mit 8 Vertiefungen (ibidi) ausplattiert und 48 Stunden vor der Bildgebung mit FugeneHD gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Zur Zellsensibilisierung vor der Laserbestrahlung bei 405 nm wurde das Wachstumsmedium vom Kammerobjektträger abgesaugt und durch frisches Medium mit 0,3 μg/ml Hoechst 33342 ersetzt. Unmittelbar vor der Bildgebung wurde das Hoechst-haltige Medium durch frisches Wachstumsmedium ersetzt. Die Lebendzellmikroskopie wurde auf einem inversen Olympus IX-83-Mikroskop durchgeführt, das mit einem hochauflösenden Yokogawa SoRa-Spinning-Disk-Kopf, einem UPlanAop 60x/1,5 NA-Ölimmersionsobjektiv für Mikrobestrahlungsexperimente und einem UPlanXApo 100×/1,35 NA ausgestattet war für Proteinlokalisierungsexperimente und eine Prime BSI sCMOS-Kamera. Die Fluoreszenz von Hoechst und EGFP wurde mit einem 405-nm- bzw. 488-nm-Festkörperlaser angeregt und die Fluoreszenzdetektion wurde mit Bandpassfiltern erreicht, die an die Fluorophor-Emissionsspektren angepasst waren. Eine Lasermikrobestrahlung bei 405 nm wurde 250 ms lang entlang einer 7-µm-Linie durch den Kern durchgeführt, wobei ein Einzelpunkt-Scankopf (Olympus cellFRAP) verwendet wurde, der an die Epifluoreszenz-Rückwand des Mikroskops gekoppelt war. Um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen, wurde die Laserleistung bei 405 nm zu Beginn jedes Experiments gemessen und auf Probenebene auf 110 µW eingestellt. Für Zeitverlaufsexperimente wurden alle 2 s Bilder aufgenommen. Für die Live-Cell-Imaging-Experimente wurden die Zellen in einer Heizkammer bei 25 °C gehalten. Die Proteinansammlung an Schadensstellen (Ad) wurde dann wie folgt berechnet:

Die Intensität innerhalb des mikrobestrahlten Bereichs wurde dann auf die Intensität vor der Schadensinduktion normalisiert.

Für Proteinlokalisierungsbilder wurden mit EGFP-markierten Proteinen transfizierte Drosophila S2R+-Zellen 30 Minuten lang in Medien mit 1 μg/ml Hoechst 33342 inkubiert. Hoechst-haltige Medien wurden vor der Bildgebung durch frische Wachstumsmedien ersetzt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in der Studie enthaltenen Atomkoordinaten wurden in der Proteindatenbank (PDB) mit den folgenden Zugangscodes hinterlegt: apo dParg, 8ADK [https://doi.org/10.2210/pdb8adk/pdb]; dParg:PARGi-Komplex, 8ADJ [https://doi.org/10.2210/pdb8adj/pdb]. Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository96 mit der Datensatzkennung PXD036512 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Vollständige Bilder der Blots und des Gels sowie die zur Erstellung der Diagramme verwendeten Daten finden Sie in der Quelldatendatei. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Alle in dieser Studie generierten Konstrukte sind auf Anfrage erhältlich und werden vom Hauptkontakt mit einer ausgefüllten Materialtransfervereinbarung erfüllt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Luca Palazzo für die unschätzbare technische Beratung, Andrea Mikoč für kritische Kommentare zum Manuskript und Diamond Light Source für den Zugang zu den Strahllinien I04 und I24 (Vorschlagsnummern mx12346 und mx18069). Wir danken außerdem Alan Wainman und der Dunn School Bioimaging Facility für die fachkundige Beratung und den Zugang zum konfokalen Mikroskop. OS wurde vom Programm der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) zur Förderung strategischer internationaler Netzwerke zur Beschleunigung der Zirkulation talentierter Forscher (S2802) unterstützt. Die Arbeit im MLN-Labor wurde teilweise vom Novo Nordisk Foundation Centre for Protein Research, der Novo Nordisk Foundation (NNF14CC0001 und NNF13OC0006477), dem Danish Council of Independent Research (0135-00096 A, 2034-00311 A und 2032-00311 A) unterstützt. und die Dänische Krebsgesellschaft (R325-A18824). Die angewandte Proteomik-Technologie war Teil eines Projekts, das im Rahmen der Fördervereinbarung EPIC-XS-823839 vom Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union gefördert wurde. Die Arbeit im Labor von IA wurde von Wellcome Trust (101794 und 210634) unterstützt; Forschungsrat für Biotechnologie und Biowissenschaften (BB/R007195/1); Forschungsallianz für Eierstockkrebs (813369); und Cancer Research United Kingdom (C35050/A22284).

Marcin J. Suskiewicz

Aktuelle Adresse: Zentrum für Molekulare Biophysik, UPR4301 CNRS, rue Charles Sadron, CEDEX 2, F-45071, Orléans, Frankreich

Antonio Ariza

Aktuelle Adresse: School of Biosciences, University of Sheffield, Western Bank, Sheffield, S10 2TN, UK

Johannes Gregor Matthias Rack

Aktuelle Adresse: MRC Centre for Medical Mycology, School of Biosciences, University of Exeter, Geoffrey Pope Building, Exeter, EX4 4QD, UK

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Pietro Fontana, Sara C. Buch-Larsen, Osamu Suyari.

Sir William Dunn School of Pathology, Universität Oxford, South Parks Road, Oxford, OX1 3RE, Großbritannien

Pietro Fontana, Osamu Suyari, Rebecca Smith, Marcin J. Suskiewicz, Kira Schützenhofer, Antonio Ariza, Johannes Gregor Matthias Rack & Ivan Ahel

Abteilung für biologische Chemie und molekulare Pharmakologie, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Peter Fontana

Programm für Zelluläre und Molekulare Medizin, Boston Children's Hospital, Boston, MA, USA

Peter Fontana

Proteomics-Programm, Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Fakultät für Gesundheits- und Medizinwissenschaften, Universität Kopenhagen, Blegdamsvej 3B, 2200, Kopenhagen, Dänemark

Sara C. Buch-Larsen und Michael L. Nielsen

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PF, SCB-L., OS, MJS, JGMR, MLN und IA haben die Studie konzipiert. PF entwarf und führte die biochemischen Studien durch. SCB-L. die massenspektrometrischen Daten erfasst und analysiert. OS führte die zellbiologischen Experimente und KS-zellbiologische unterstützende Studien durch. RS führte Mikroskopieexperimente durch. PF, MJS und AA lösten die Kristallstrukturen. JGMR führte die phylogenetische Analyse durch, unterstützte Datenanalysen und Interpretation, PF, SCB-L., OS, AA, JGMR, MLN und IA verfassten das Manuskript mit Beiträgen aller Autoren.

Korrespondenz mit Antonio Ariza, Johannes Gregor Matthias Rack, Michael L. Nielsen oder Ivan Ahel.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Georges Mer und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Fontana, P., Buch-Larsen, SC, Suyari, O. et al. Die Serin-ADP-Ribosylierung in Drosophila bietet Einblicke in die Entwicklung der reversiblen ADP-Ribosylierungssignalisierung. Nat Commun 14, 3200 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38793-y

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Eingegangen: 14. September 2022

Angenommen: 16. Mai 2023

Veröffentlicht: 02. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38793-y

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