Interspezies-Konkurrenz in oralen Biofilmen, vermittelt durch die extrazelluläre Desoxyribonuklease SsnA von Streptococcus gordonii

npj Biofilms and Microbiomes Band 8, Artikelnummer: 96 (2022) Diesen Artikel zitieren

1299 Zugriffe

9 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Extrazelluläre DNA (eDNA) ist ein Schlüsselbestandteil vieler mikrobieller Biofilme, einschließlich Zahnbelag. Die Rolle extrazellulärer Desoxyribonuklease (DNase)-Enzyme in Biofilmen ist jedoch kaum bekannt. Streptococcus gordonii ist ein Pionier der Besiedelung von Zahnbelag. Hier haben wir SsnA identifiziert und charakterisiert, ein Zellwand-assoziiertes Protein, das für die extrazelluläre DNase-Aktivität von S. gordonii verantwortlich ist. Die SsnA-vermittelte extrazelluläre DNase-Aktivität von S. gordonii wurde nach dem Wachstum von Zuckern unterdrückt. SsnA wurde als rekombinantes Protein gereinigt und erwies sich unterhalb eines pH-Werts von 6,5 als inaktiv. SsnA hemmte die Biofilmbildung durch Streptococcus mutans auf pH-abhängige Weise. Darüber hinaus hemmte SsnA das Wachstum oraler Mikrokosmos-Biofilme im menschlichen Speichel. Die Hemmung wurde jedoch durch die Zugabe von Saccharose verbessert. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass S. gordonii SsnA eine Schlüsselrolle im Wettbewerb zwischen den Arten innerhalb oraler Biofilme spielt. Die Ansäuerung des Mediums durch Zuckerkatabolismus könnte eine Strategie für kariogene Arten wie S. mutans sein, um den SsnA-vermittelten Ausschluss aus Biofilmen zu verhindern.

Die Mundhöhle beherbergt typischerweise zwischen etwa 100 und 300 verschiedene Bakterientaxa, die die Oberflächen von Hart- und Weichgewebe besiedeln1. Die taxonomische Zusammensetzung und Verteilung von Bakterien in oralen Biofilmen wird durch selektive Adhäsionsprozesse, konkurrierende und gegenseitige Wechselwirkungen zwischen Arten und der vom Wirt bereitgestellten Umgebung bestimmt2,3,4,5. Die Ansammlung von Zahnbelag, dem Biofilm, der sich auf den Zahnoberflächen bildet, erfolgt in einer räumlich-zeitlich geordneten Weise6. Pionierkolonisatoren, die in der Lage sind, an der erworbenen Zahnschmelzmembran zu haften, bilden die Grundlage für Zahnbelag und stellen Rezeptoren für die Rekrutierung sekundärer Kolonisatoren bereit, was schließlich zur Entwicklung komplexer und dynamischer mikrobieller Gemeinschaften führt7,8. Pionierkolonisatoren gelten im Allgemeinen als Kommensalen oder sogar als nützlich für die Erhaltung der Mundgesundheit2,9,10. Wenn der Zahnbelag jedoch nicht richtig bekämpft wird, kann es zu Zahnkaries oder Parodontitis kommen11. Diese beiden Erkrankungen sind weltweit für die überwiegende Mehrheit der Zahnverluste verantwortlich12. Krankheiten sind mit Veränderungen in der Zusammensetzung und den biochemischen Aktivitäten des Zahnbelags verbunden, die zu einem Zustand der Dysbiose führen13,14. Bei Zahnkaries führt eine übermäßige Aufnahme von Zucker in der Nahrung zu dysbiotischen Biofilmen, die mit sauren und säurebildenden Bakterien angereichert sind, die den pH-Wert an der Zahnoberfläche senken und die Demineralisierung von Zahnschmelz oder Zahnzement vorantreiben. Ein weiteres Fortschreiten der Läsion führt zur Zerstörung des Dentins und zum Eindringen von Bakterien in die Pulpakammer15,16.

Pionierkolonisatoren wie Streptokokken der Mitis-Gruppe spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des übermäßigen Wachstums säurebildender und kariogener Bakterien wie Streptococcus mutans. Beispielsweise exprimiert Streptococcus gordonii ein Arginin-Desaminase-System (AD), das der Versauerung des Biofilms entgegenwirkt, indem es Ammoniak und Kohlendioxid erzeugt und gleichzeitig Energie für die Zellen produziert9,17,18,19,20. In Gegenwart von Sauerstoff produzieren S. gordonii und andere Mitglieder der Mitis-Streptokokkengruppe, einschließlich Streptococcus sanguinis, erhebliche (millimolare) Mengen an Wasserstoffperoxid (H2O2), das das Wachstum von S. mutans21 hemmen kann. Darüber hinaus ist es möglich, dass die Pionierkolonisierer mit S. mutans um Bindungsstellen innerhalb des Biofilms konkurrieren. Die Bindung von S. mutans hängt stark von der Anwesenheit von Saccharose ab, die extrazellulär metabolisiert wird, um Glucane zu produzieren, die die Adhäsion und Biofilmbesiedlung unterstützen22. In Abwesenheit von Saccharose scheint die Adhäsion von S. mutans durch extrazelluläre DNA (eDNA) vermittelt zu werden23. Extrazelluläre DNA ist auch wichtig für die strukturelle Integrität reifer S. mutans-Biofilme, da die Behandlung mit DNase I zur Ausbreitung des Biofilms führt24,25. Kürzlich wurde gezeigt, dass eDNA in komplexeren Biofilmen vorhanden ist, einschließlich gemischter Zahnplaques26,27,28,29,30,31. Die Behandlung von Zahnbelag, insbesondere in den frühen Entwicklungsstadien, mit exogenen DNase-Enzymen reduziert die Biofilm-Biomasse erheblich und dezimiert selektiv bestimmte Arten, die besonders auf eDNA angewiesen zu sein scheinen27,31,32. Darüber hinaus dient eDNA als Nährstoffquelle und Reservoir für den horizontalen Gentransfer innerhalb der Zahnplaque3,16.

Viele Bakterien produzieren oberflächengebundene oder sezernierte Desoxyribonuklease (DNase)-Enzyme33,34. In Biofilmen erfüllen extrazelluläre DNasen eine Vielzahl von Funktionen, darunter die Verbreitung von Bakterienzellen, den eDNA-Umsatz und den horizontalen Gentransfer8,35,36,37,38. Bei Krankheitserregern werden extrazelluläre DNase-Enzyme oft mit Virulenz und der Umgehung von Immunantworten des Wirts wie Neutrophilen-Extrazellulärfallen (NETs) in Verbindung gebracht39,40. Eine Reihe oraler Bakterien, darunter S. gordonii, produzieren extrazelluläre DNase-Enzyme33,34,41. Ihre Funktionen bei der Aufrechterhaltung des Biofilms und bei der Interaktion zwischen den Arten sind jedoch kaum verstanden. Hier haben wir das Enzym identifiziert und charakterisiert, das für die extrazelluläre DNase-Aktivität von S. gordonii verantwortlich ist. Darüber hinaus untersuchten wir die Wirkung dieses Enzyms auf die Entwicklung von S. mutans-Biofilmen oder komplexeren gemischten Biofilmen, die von menschlichen Mundbakterien gebildet werden.

Um das Ausmaß der eDNA in der Matrix der Biofilme S. gordonii DL1 und S. mutans GS-5 zu bestimmen, wurde eDNA aus Monospezies-Biofilmen extrahiert, die 48 Stunden lang statisch gezüchtet wurden. Eine Bande mit hohem Molekulargewicht (> 10 kbp) wurde in Extrakten beobachtet, die aus S. mutans-Biofilmen isoliert wurden, jedoch nicht in S. gordonii-Biofilmen (Abb. 1a). Die Größe des Fragments ähnelte der intrazellulären chromosomalen DNA (iDNA), die aus S. mutans-Zellen extrahiert wurde. Diese Bande wurde nach enzymatischer Behandlung der Extrakte mit DNase I nicht beobachtet (ergänzende Abbildung 1). Die spektrophotometrische NanoDrop-Analyse der Extrakte ergab, dass eDNA etwa 19 % der gesamten DNA (iDNA + eDNA) in S. mutans-Biofilmen ausmachte, während sie in S. gordonii-Biofilmen nur 6 % der gesamten DNA ausmachte. Die Rolle der eDNA bei der Aufrechterhaltung der Integrität von S. mutans- und S. gordonii-Biofilmen wurde untersucht, indem vorgeformte S. mutans- und S. gordonii-Biofilme 1 Stunde lang bei 37 °C mit 5 µg/ml DNase I behandelt wurden (Abb. 1b). , C). Die Kristallviolettfärbung ergab, dass die DNase-I-Behandlung die Biomasse des S. mutans-Biofilms signifikant um >90 % reduzierte. Im Gegensatz dazu wurden S. gordonii-Biofilme durch die DNase I-Behandlung nicht beeinträchtigt. Der Einschluss von DNase I während der Biofilmentwicklung hemmte die Ansammlung von S. mutans-Biofilmen erheblich, hatte jedoch keinen Einfluss auf S. gordonii (Abb. 1d).

a Agarosegelelektrophorese von intrazellulärer und extrazellulärer DNA (iDNA und eDNA), isoliert aus S. gordonii- und S. mutans-Biofilmen. Biofilme wurden 48 Stunden lang in Platten mit mehreren Vertiefungen gezüchtet und die Zellen wurden vor der DNA-Extraktion durch Zentrifugation von der extrazellulären Matrix getrennt. Der schwarze Pfeil zeigt eDNA an. Marker (M) wurde auf demselben Gel wie die S. gordonii-Proben laufen gelassen, jedoch getrennt von den Probenspuren. S. mutans-Proben wurden auf einem anderen Gel laufen gelassen. b Vorgefertigte Biofilme von S. gordonii und S. mutans, die 20 Stunden lang in BHY-Medium gezüchtet wurden, wurden 1 Stunde lang bei 37 °C mit 5 μg/ml DNase I behandelt. Biofilme wurden mit Kristallviolett gefärbt und die Biomasse wurde durch Auflösen des Farbstoffs und Messen der Absorption bei 570 nm quantifiziert. c Quantifizierung von mit Kristallviolett gefärbten S. gordonii DL1- und S. mutans GS-5-Biofilmen, die in Gegenwart und Abwesenheit von 5 μg/ml DNase I gezüchtet wurden. Biofilme wurden 20 Stunden lang in BHY bei 37 °C anaerob gezüchtet. CS-Mutans-Biofilme, jedoch nicht S . gordonii wurden gehemmt, wenn sie in Gegenwart von 5 μg/ml DNase I gezüchtet wurden. d Die Quantifizierung vorgebildeter S. mutans-Biofilme, die 1 Stunde lang bei 37 °C mit 5 μg/ml DNase I behandelt wurden, zeigte eine signifikante Reduktion durch DNase I-Behandlung ( Ausbreitung), wohingegen S. gordonii-Biofilme nicht reduziert wurden. Datenpunkte werden für 4–6 unabhängige Experimente angezeigt, Balken stellen den Mittelwert dar und SD ist angegeben. Die Datenverteilung bestand den Shapiro-Wilk-Normalitätstest und daher wurde die statistische Signifikanz mithilfe des Student-t-Tests berechnet. ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Wir stellten die Hypothese auf, dass niedrige Mengen an eDNA in S. gordonii-Biofilmen auf die Produktion eines extrazellulären DNase-Enzyms zurückzuführen sein könnten. Durch das Screening des S. gordonii DL1-Genoms mit NCBI Blast wurden drei Gene identifiziert, die möglicherweise Proteine ​​mit DNase-I-Typ-Domänen kodieren. Von diesen wiesen Gene, die für ein Exonuklease-III-Enzym und ein mit RgfB markiertes Protein kodierten, keine Eigenschaften von sekretierten Proteinen auf. Das dritte Gen (SGO_RS08090; GenBank Accession WP_012130709.1) kodierte ein mutmaßliches 779-Aminosäuren-Protein mit einem N-terminalen Sekretionssignal und einem C-terminalen LPxTG-Motiv für die durch Sortase vermittelte Verankerung an der Zellwand, was auf eine extrazelluläre Zellwand hinweist. gebundenes Enzym (Abb. 2a). Aufgrund der Homologie zu anderen extrazellulären Nukleasen von Streptokokken, einschließlich SsnA von Streptococcus suis42, wurde das mutmaßliche DNase-Gen von S. gordonii als ssnA (Streptococcal Surface Nuclease A) bezeichnet. Um zu testen, ob das ssnA-Gen für die extrazelluläre DNase-Aktivität in S. gordonii verantwortlich ist, wurde ssnA ausgeschaltet und die extrazelluläre DNase-Aktivität mithilfe von DNase-Testagar bewertet (Abb. 2b). Um Kolonien von Wildtyp-S. gordonii war eine Clearance-Zone sichtbar, was darauf hindeutet, dass diese Zellen extrazelluläre DNase produzierten. Im Gegensatz dazu wurde in der ∆ssnA-Mutante keine extrazelluläre DNase-Aktivität nachgewiesen. Die genetische Komplementierung des ssnA-Gens unter seinem nativen Promotor (S. gordonii ssnAComp) stellte die DNase-Aktivität wieder her (Abb. 2b).

a Schematische Darstellung der Domänenorganisation des vom ssnA-Gen kodierten Proteins. Positionen vorhergesagter Domänen, einschließlich eines mutmaßlichen Signalpeptids (SP), einer OB-Faltung, einer Nukleasedomäne und eines LPxTG-Zellwandverankerungsmotivs, werden mit Start- und End-Aminosäurerestnummern vom N-Terminus markiert. b Die extrazelluläre DNase-Aktivität wurde unter Verwendung von DNase-Testagar bewertet. Ein klarer Lichthof um Kolonien von wildem S. gordonii DL1 weist auf DNase-Aktivität hin. In S. gordonii ΔssnA war kein Halo sichtbar, wohingegen die extrazelluläre DNase-Aktivität in S. gordonii ssnAComp wiederhergestellt wurde. c Die Zellfraktion und das verbrauchte Kulturmedium wurden durch Zentrifugation planktonischer Kulturen des Wildtyps S. gordonii, der ΔssnA-Mutante und der ssnAComp-Stämme getrennt und die Nukleaseaktivität jeder Fraktion wurde mithilfe eines fluoreszenzbasierten quantitativen Assays bestimmt. Als Kontrolle wurde S. aureus FH7 einbezogen. Die extrazelluläre DNase-Aktivität von S. gordonii war hauptsächlich mit den Zellen verbunden, wohingegen die DNase-Aktivität von S. aureus im konditionierten Medium höher war. Bei der Analyse wurden identische Volumina an Zell- und Überstandsfraktionen verwendet. Datenpunkte werden für 3 unabhängige Wiederholungen angezeigt, Balken stellen den Mittelwert dar und SD ist angegeben.

Um die Produktion von SsnA in S. gordonii weiter zu untersuchen, wurde ein quantitativer fluoreszenzbasierter DNase-Aktivitätstest eingesetzt (Abb. 2c). Die DNase-Aktivität wurde in zellgebundenen Fraktionen und Überständen bestimmt. Als Kontrolle wurde Staphylococcus aureus FH7 einbezogen, von dem bekannt ist, dass er DNase in das extrazelluläre Milieu freisetzt. Bei Wildtyp-S. gordonii war die DNase-Aktivität in der zellassoziierten Fraktion etwa fünfmal höher als im verbrauchten Medium, was darauf hindeutet, dass der Großteil des sekretierten SsnA an der Zellwand gebunden bleibt. Die DNase-Aktivität war in der Zellfraktion und im verbrauchten Medium von S. gordonii ΔssnA nahezu nicht nachweisbar. Die extrazelluläre DNase-Aktivität wurde im komplementierten Stamm wiederhergestellt und war größtenteils mit der zellulären Fraktion verbunden.

Zunächst wurde die Expression und Aktivität von SsnA durch das Wachstum von S. gordonii in BHY überwacht (Abb. 3a). Zwischen 2 und 25 Stunden wurde kein signifikanter Unterschied in der zellassoziierten SsnA-Aktivität festgestellt (Abb. 3b). Die Genexpression von ssnA im Verhältnis zur Expression des 16 S-rRNA-Gens war auch während der exponentiellen Wachstumsphase stabil. Allerdings nahm die Expression während der stationären Phase ab und war nach 25 Stunden um das mehr als 30-fache signifikant reduziert (Abb. 3c).

a Wachstumskurve von S. gordonii, die aerob in BHY bei 37 °C gewachsen ist. b Dargestellt ist die DNase-Aktivität von Zellen, die nach 2, 4, 6 und 25 Stunden mit dem quantitativen Fluoreszenzassay gemessen wurde. Zur Normalisierung wurden Messungen der optischen Dichte (OD600 nm) verwendet. c-RNA wurde zu verschiedenen Zeitpunkten während des Wachstums aus den Proben extrahiert, um die ssnA-Expression mithilfe von RT-qPCR zu bewerten. Die Faltungsänderung wurde auf die 16 S-rRNA-Genexpression normalisiert. Für jeden Test werden die Ergebnisse von 3 unabhängigen Experimenten und SE angezeigt. Die Datenverteilung hat den Shapiro-Wilk-Normalitätstest bestanden. Gewöhnliche einfaktorielle ANOVA und Dunnett-Mehrfachvergleiche wurden mit GraphPad Prism 9 durchgeführt, um die statistische Signifikanz zu bestimmen; ****p < 0,0001.

Die Sequenzanalyse der Promotorregion von ssnA ergab eine Konsensbindungsstelle für Kohlenstoffkatabolit-Protein A (CcpA) oder möglicherweise für das Maltose-Regulator-MalR-Protein (ergänzende Abbildung 2a). Um festzustellen, ob CcpA oder MalR eine Rolle bei der Regulierung der SsnA-Expression spielen, wurden ∆ccpA- und ∆malR-Mutanten konstruiert und die extrazelluläre DNase-Aktivität in Stämmen bewertet, die in Gegenwart oder Abwesenheit von zugesetztem Zucker gezüchtet wurden (ergänzende Abbildung 2b). Bei grampositiven Bakterien wie S. gordonii ist CCR mit der Aufnahme von Zuckern durch das Phosphoenolpyruvat-abhängige Zucker:Phosphotransferase-System (PTS) verbunden. Die Substratspezifität wird durch die Enzym-II-Komponente (EII) des PTS bestimmt. Der EIIMan-Komplex von S. gordonii scheint eine breite Substratspezifität zu haben43 und wir konnten keinen Zucker identifizieren, der von S. gordonii verwendet wird und keine CCR auslöst (Lin Zeng, persönliche Mitteilung). Als Kontrolle wurde gereinigtes SsnA und unter allen getesteten Bedingungen DNA abgebaut, was durch eine Clearance-Zone auf dem Agar angezeigt wird. Beim Wildtyp S. gordonii wurde ein DNA-Abbau in Abwesenheit von zugesetztem Zucker oder in Galaktose beobachtet, jedoch nicht in Glucose, Maltose oder Saccharose. Interessanterweise wurde DNase-Aktivität in der ∆ccpA-Mutante beobachtet, die in Gegenwart oder Abwesenheit eines der getesteten Zucker gezüchtet wurde (ergänzende Abbildung 2). Ein genetisch ergänzter Stamm, S. gordonii ccpAComp, zeigte ein ähnliches Muster der DNase-Aktivität wie der Wildtyp. Die Löschung von malR hatte keinen Einfluss auf die DNase-Aktivität, was darauf hindeutet, dass dieser Repressor unter den hier getesteten Bedingungen nicht an der Regulierung der ssnA-Expression beteiligt ist.

Um das Ausmaß der Zuckerhemmung der SsnA-Aktivität zu quantifizieren, wurde die DNase-Aktivität von Zellen, die in BHY-Medium oder mit verschiedenen Zuckern ergänztem BHY gezüchtet wurden, mithilfe eines fluoreszenzbasierten Assays gemessen (Abb. 4a). Die DNase-Aktivität von S. gordonii war in Gegenwart von Glucose, Maltose, Galactose, Fructose oder Inulin um >50 % reduziert. Streptokokken produzieren Säure aus Zuckern und es war möglich, dass die DNase-Enzymaktivität durch den pH-Wert der Kulturen beeinflusst wurde. Der pH-Wert der Überstände von S. gordonii-BHY-Kulturen in der stationären Phase betrug ungefähr 5,6, wohingegen der pH-Wert der mit Galactose gezüchteten Kulturen ungefähr 4,6 betrug (Abb. 4b). In Kulturen, die mit Glucose, Maltose, Fructose oder Inulin gezüchtet wurden, wurde der pH-Wert weiter auf 4 bis 4,2 gesenkt. Um den Einfluss eines niedrigen pH-Werts auf die DNase-Aktivität zu beurteilen, wurde BHY durch Zugabe von HCl auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt und zur Kultivierung von S. gordonii-Zellen in der stationären Phase verwendet. Der endgültige pH-Wert nach dem Wachstum betrug ungefähr 4,2 und in Zellen, die in angesäuertem BHY gezüchtet wurden, wurde fast keine DNase-Aktivität festgestellt (Abb. 4).

a Extrazelluläre Nukleaseaktivität von S. gordonii DL1, gezüchtet in BHY oder BHY + 2 % (w/v) Zucker: Glucose (BHYG), Maltose (BHYM), Galactose (BHYGal), Fructose (BHYF) oder Inulin (BHYI). Die extrazelluläre DNase-Aktivität von S. gordonii-Zellen, die in angesäuertem BHY/HCl-Medium (BHY mit HCl auf pH 5,5 geändert) gezüchtet wurden, ist durch eine rote Linie getrennt dargestellt. Datenpunkte werden für 3 unabhängige Wiederholungen angezeigt, Balken stellen den Mittelwert dar und SD ist angegeben. b Der pH-Wert von Kulturen nach dem Wachstum bis zur stationären Phase in BHY, BHY + Zuckern oder in BHY/HCl. c S. gordonii DL1-Übernachtkulturen wurden geerntet und in Puffer bei pH 7,1 (blaue Linie), 5,5 (rote Linie) oder 4,5 (magentafarbene Linie) resuspendiert. Nach 2 Stunden (roter Pfeil) wurden die Zellen geerntet und in PBS (pH 7,1) oder PBS (pH 7,1), ergänzt mit Chloramphenicol (Chlm; 12,5 μg/ml; hell- und dunkelgrüne Linien), resuspendiert. DNase-Aktivität wird für zellassoziiertes SsnA gezeigt. Datenpunkte werden für 3 unabhängige Wiederholungen angezeigt, Balken stellen den Mittelwert dar und SD ist angegeben. Zur Normalisierung wurden in jedem Assay Messungen der optischen Dichte (OD600 nm) verwendet.

Wir gingen davon aus, dass die Auswirkungen eines niedrigen pH-Werts auf die SsnA-Aktivität nicht direkt auf eine Enzymhemmung zurückzuführen sind, da der Test nach dem Waschen der Zellen und dem Resuspendieren in PBS bei pH 7,1 durchgeführt wurde. Um die pH-vermittelte Reduktion der SsnA-Aktivität weiter zu untersuchen, wurde S. gordonii DL1 in neutralen oder sauren Puffern inkubiert und in Gegenwart oder Abwesenheit des Proteinsyntheseinhibitors Chloramphenicol auf pH 7,1 übertragen (Abb. 4c). Die gesamte DNase-Aktivität war in Zellen, die bei pH 4,5 oder 5,5 inkubiert wurden, niedriger als in Zellen, die bei pH 7,1 inkubiert wurden. Nach einer Verschiebung auf pH 7,1 nahm die SsnA-Aktivität in Zellen zu, die in Puffer mit pH 4,5 inkubiert wurden. Die Wiederherstellung der SsnA-Aktivität war in Gegenwart von Chloramphenicol beeinträchtigt, was darauf hindeutet, dass zur Wiederherstellung der Enzymaktivität eine De-novo-Proteinsynthese erforderlich war. In Zellen, die 2 Stunden lang bei pH 5,5 inkubiert wurden, stieg die SsnA-Aktivität nach einer Verschiebung auf pH 7,1 leicht, aber nicht signifikant an. In Gegenwart von Chloramphenicol nahm die SsnA-Aktivität nach dem Übergang auf pH 7,1 weiter ab, was darauf hindeutet, dass das aktive Enzym nicht wiederhergestellt wurde.

Um die Enzymaktivität genauer zu charakterisieren, wurde SsnA als GST-markiertes Konstrukt gereinigt. Die Identität des gereinigten Konstrukts wurde durch Peptid-Massen-Fingerprinting bestätigt (ergänzende Abbildung 3). In Vorversuchen wurde der GST-Tag mit Thrombin gespalten und durch Affinitätsreinigung entfernt. Es wurde gezeigt, dass das Enzym mit oder ohne GST-Tag aktiv ist (ergänzende Abbildung 4). Da die Entfernung des Tags zu einem erheblichen Ertragsverlust des Proteins führte, verwendeten wir für nachfolgende Experimente das GST-markierte Konstrukt. Zunächst wurden die Auswirkungen des pH-Werts auf die DNase-Aktivität untersucht (Abb. 5a). Der optimale pH-Wert lag zwischen 7 und 9,5. Unter pH 6,5 und über pH 10,5 war keine Aktivität nachweisbar.

a Die Nukleaseaktivität von gereinigtem SsnA wurde bei einem pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 11 quantifiziert. b Mithilfe des quantitativen Fluoreszenzassays wurde die DNase-Aktivität von SsnA in Gegenwart verschiedener Mn2+-, Ca2+-, Mg2+- und Zn2+-Konzentrationen getestet. Negativkontrollen ohne Enzym sind angegeben. In allen Feldern geben Punkte oder Balken Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten an, und SE wird angezeigt.

Nukleasen sind häufig auf einen zweiwertigen Metall-Cofaktor angewiesen44. Die Analyse von SsnA mittels induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) konnte keine mit dem gereinigten Protein assoziierten Metallionen nachweisen. Um die bevorzugten Metall-Cofaktoren für SsnA zu bestimmen, wurde die enzymatische Aktivität von SsnA in Gegenwart von Mn2+, Ca2+, Mg2+ oder Zn2+ getestet (Abb. 5b). In Abwesenheit zugesetzter Metalle wurde in SsnA-Präparaten keine DNase-Aktivität festgestellt. Die Zugabe von 10 µM MnCl2, 20 µM CaCl2, 40 µM MgCl2 oder 40 µM ZnSO4 führte zu einer hohen DNase-Aktivität. Eine Erhöhung der ZnSO4-Konzentration auf 80 µM führte zu einer nahezu vollständigen Inaktivierung der DNase. Die DNase-Aktivität wurde auch in hohen Konzentrationen von MnCl2 (>1,28 mM MnCl2) aufgehoben.

Wie oben gezeigt, reagierten S. mutans GS-5-Biofilme empfindlich auf die Behandlung mit DNase I, S. gordonii-Biofilme dagegen nicht. Wir stellten die Hypothese auf, dass SsnA auch vorgebildete S. mutans-Biofilme zerstreuen würde. Mithilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie wurden S. mutans-Biofilme durch die Behandlung mit SsnA fast vollständig entfernt (Abb. 6a). Es wurde festgestellt, dass die Hemmung vom vorherrschenden pH-Wert abhängt (Abb. 6b). Bei pH 4 oder 5 wurden Biofilme durch SsnA nicht entfernt. Im Gegensatz dazu wurden S. mutans-Biofilme durch DNase I bei pH 5 auf <40 % der Kontrollbiomasse (ohne Enzymbehandlung) reduziert. Bei pH 6 waren sowohl DNase I als auch SsnA wirksam bei der Reduzierung von S. mutans-Biofilmen und die Biomasse wurde reduziert auf <40 % der Kontrollen. Bei pH 7 war die Entfernung des Biofilms sogar noch größer, und nach der Behandlung mit DNase I oder SsnA verblieben nur 10–20 % des Biofilms. Basierend auf diesen Erkenntnissen stellten wir die Hypothese auf, dass S. gordonii-Wildtypzellen, die SsnA exprimieren, S. mutans GS-5-Biofilme zerstreuen könnten. Um diese Hypothese zu testen, wurden vorgefertigte S. mutans-Biofilme, die 20 Stunden lang gezüchtet wurden, mit S. gordonii-Wildtyp- oder ΔssnA-Zellen oder mit verbrauchtem Kulturmedium behandelt (ergänzende Abbildung 5). Die Behandlung mit Wildtyp-S.-gordonii-Zellen oder Kulturüberstand reduzierte die S.-mutans-Biofilm-Biomasse deutlich auf etwa 60 % der Kontrolle. Im Gegensatz dazu führte die Behandlung mit S. gordonii ΔssnA-Zellen nicht zu einer Reduzierung der S. mutans-Biofilme. Nach der Behandlung mit S. gordonii ΔssnA-Kulturüberstand wurde eine kleine, aber signifikante Verringerung der S. mutans-Biofilme beobachtet (ergänzende Abbildung 5). Insgesamt zeigen diese Daten, dass SsnA die Entfernung von S. mutans-Biofilmen durch S. gordonii fördert.

a Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie von vorgefertigten 20-Stunden-Biofilmen von S. mutans, behandelt mit PBS (Kontrolle) oder 5 µg/ml SsnA für 1 Stunde bei 37 °C. Zur Visualisierung der Zellen wurde Propidiumiodid (20 μM) verwendet. Maßstabsbalken sind 30 µm (linke Felder) oder 20 µm (rechte Felder). b Biomasse von vorab gebildeten S. mutans-Biofilmen, behandelt mit DNase I (5 µg/ml) oder SsnA (5 µg/ml) bei pH 4, 5, 6 und 7. Zur Quantifizierung wurde ein Kristallviolett-Assay verwendet. Datenpunkte werden für 3 unabhängige Wiederholungen angezeigt, Balken stellen den Mittelwert dar und SD ist angegeben.

Um festzustellen, ob SsnA die Entwicklung komplexerer oraler Biofilme steuern kann, verwendeten wir ein BioFlux-Mikrofluidiksystem mit doppeltem Einlass, um orale Mikrokosmos-Biofilme in Gegenwart oder Abwesenheit von SsnA unter dem Fluss von natürlichem Speichel als einziger Nährstoffquelle wachsen zu lassen. Das System wurde mit unsterilisiertem Speichel beimpft, um die Kanäle auszusäen. Biofilme wurden 20 Stunden lang kultiviert und alle 10 Minuten wurden Bilder aufgenommen (Abb. 7a; Zusatzfilm 1). Während des 20-stündigen Wachstums wurde in der Hälfte des Kanals, in dem SsnA enthalten war, eine deutliche Hemmung der oralen Mikrokosmosentwicklung beobachtet. Die Färbung extrazellulärer DNA (eDNA) mit Yoyo-1 zeigte, dass die eDNA auch in Gegenwart von SsnA deutlich reduziert wurde. Das Fluoreszenzsignal wurde im Verlauf der Biofilmbildung quantifiziert (Abb. 7b). Über 20 Stunden der Biofilmentwicklung wurde in der oberen Hälfte des Kanals (Kontrolle) ein konsistenter Anstieg der eDNA-Spiegel beobachtet, während in der unteren Hälfte (SsnA-ergänzt) die eDNA-Spiegel während des gesamten Experiments stabil blieben.

a Visualisierung oraler Mikrokosmos-Biofilme, die sich im Kanal des BioFlux-Mikrofluidiksystems mit Doppeleinlass entwickeln, wobei Speichel, der SsnA (5 µg/ml) enthält, die untere Hälfte des Kanals speist. Mikrokosmos-Biofilme wurden 20 Stunden lang gezüchtet. Yoyo-1 (2,4 nM) wurde verwendet, um eDNA im Biofilm anzufärben. b Quantifizierung der eDNA-Akkumulation für den SsnA-haltigen und SsnA-freien Abschnitt des Wachstumskanals über 20 h. Alle 10 Minuten wurden Bilder aufgenommen und die eDNA-Mengen mithilfe von GrayValue in der FIJI-Software bestimmt. c Visualisierung von Mikrokosmos-Biofilmen, die in mit 0,3 % Saccharose angereichertem natürlichem Speichel gezüchtet wurden. SsnA (5 µg/ml) wurde in das Reservoir aufgenommen, das die untere Hälfte des Kanals versorgt. Yoyo-1 (2,4 nM) wurde zur eDNA-Färbung einbezogen. d Quantifizierung der eDNA-Akkumulation für den SsnA-haltigen und SsnA-freien Abschnitt des Wachstumskanals über 20 Stunden Wachstum in Speichel, ergänzt mit 0,3 % Saccharose. Alle 10 Minuten wurden Bilder aufgenommen und die eDNA-Mengen mithilfe von GrayValue in der FIJI-Software bestimmt. Mittelwert und SE von 3 unabhängigen Wiederholungen werden angezeigt. Maßstabsbalken sind 50 µm.

Frühere Arbeiten hatten gezeigt, dass Zucker zu einer Senkung des pH-Werts und einer Unterdrückung der SsnA-Enzymaktivität führt (Abb. 4). Um die Auswirkungen von Zucker auf die Kontrolle oraler Mikrokosmos-Biofilme durch SsnA zu beurteilen, wurden Biofilme im BioFlux-System in Speichel, ergänzt mit 0,3 % Saccharose, kultiviert (Abb. 7c; Zusatzfilm 2). Unter diesen Bedingungen wurde in Gegenwart von SsnA keine Verringerung der Biofilmakkumulation beobachtet (Abb. 7c, d). Um den Einfluss von Saccharose auf die eDNA in oralen Mikrokosmos-Biofilmen weiter zu untersuchen, wurde die extrazelluläre Nuklease NucB aus Bacillus licheniformis eingesetzt, da zuvor gezeigt wurde, dass sie die Entwicklung oraler Mikrokosmos-Biofilme unter statischen Bedingungen kontrolliert31. In Gegenwart von NucB war die Biofilmentwicklung im Speichel im Vergleich zu Kontrollen stark gehemmt (Abb. 8a, b; Zusatzfilm 3). Eine ähnliche Hemmung wurde bei Kulturen beobachtet, die in mit 0,3 % Saccharose angereichertem Speichel gezüchtet wurden (Abb. 8c, d; Zusatzfilm 4). Zusammengenommen deuten die obigen Daten darauf hin, dass eDNA für die Entwicklung oraler Mikrokosmos-Biofilme wichtig ist und dass SsnA die eDNA-abhängige Biofilmakkumulation in Gegenwart von Saccharose nicht wirksam kontrolliert.

a Orale Mikrokosmos-Biofilme, die 20 Stunden lang in natürlichem Speichel gezüchtet und mit NucB im unteren Teil des Mikrofluidikkanals ergänzt wurden. Für die eDNA-Visualisierung wurde der Farbstoff Yoyo-1 (2,4 nM) verwendet. b eDNA, quantifiziert in den beiden Hälften des Wachstumskanals über einen Zeitraum von 20 Stunden Wachstum. Die eDNA wurde durch GrayValue-Bestimmung in der FIJI-Software für Bilder gemessen, die alle 10 Minuten aufgenommen wurden. c Mit Saccharose (0,3 %) ergänzter Speichel wurde zum Züchten von Mikrokosmos-Biofilmen verwendet und NucB wurde in die untere Hälfte des Wachstumskanals einbezogen. d eDNA, quantifiziert für die NucB-haltigen und NucB-freien Hälften des Wachstumskanals über 20 Stunden Wachstum in Saccharose (0,3 %) enthaltendem Speichel. Mittelwert und SE von 3 unabhängigen Wiederholungen werden angezeigt. Maßstabsbalken sind 50 µm.

Hier haben wir SsnA identifiziert und charakterisiert, ein extrazelluläres zellwandassoziiertes DNase-Enzym, das von S. gordonii produziert wird. Extrazelluläre DNase-Enzyme werden häufig von pathogenen Streptokokkenarten produziert und sind wichtige Virulenzfaktoren39,45,46,47. Eine Reihe oraler kommensaler Streptokokken, darunter S. sanguinis, Streptococcus intermedius, Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguinis und Streptococcus mitis, erzeugen nachweisbare Mengen an extrazellulärer DNase-Aktivität34,41. Davon wurde nur die extrazelluläre DNase von S. sanguinis charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass dieses Enzym mit der Bezeichnung SWAN (Streptococcal Wall-Anchored Nuclease) das Entkommen aus extrazellulären Neutrophilenfallen (NETs) vermittelt41. Es gibt Hinweise darauf, dass S. mutans mithilfe der Desoxyribose-Aldolase DeoC48 auch aus NETs entkommen kann. Allerdings ist die extrazelluläre Nukleaseproduktion durch S. mutans in DNase-Aktivitätstests schwach oder nicht nachweisbar34. Unsere Daten haben eine Rolle von S. gordonii SsnA bei der Modulation der Biofilmbildung durch konkurrierende Arten wie S. mutans identifiziert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Fähigkeit von SsnA, den Wettbewerb zwischen den Arten innerhalb von Biofilmen zu vermitteln, vom vorherrschenden pH-Wert und der Zuckerkonzentration abhängt. Daher scheint es, dass extrazelluläre Streptokokken-DNasen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Stabilität von Zahnbelag-Biofilmen spielen könnten.

SsnA wurde identifiziert, indem das S. gordonii-Genom nach Genen durchsucht wurde, die für Proteine ​​mit DNase I-ähnlichen Domänen kodieren. Die DNase I-Familie umfasst eine Vielzahl von Nukleasen und Phosphatasen, die eine konservierte Proteinfalte teilen49. Obwohl unsere Analyse darauf hindeutet, dass der Großteil von SsnA zellgebunden ist, ergab eine massenspektrometrische Untersuchung des gesamten Sekretoms von S. gordonii das Vorhandensein von SsnA (SGO_1651) unter 107 sekretierten Proteinen50. Daher ist es wahrscheinlich, dass ein Teil des Enzyms von der Zelloberfläche freigesetzt wird. Homologe von S. gordonii SsnA kommen in einer Vielzahl oraler Streptokokken vor, darunter S. sanguinis, S. intermedius, S. constellatus, S. anginosus und S. parasanguinis (ergänzende Abbildung 6), was darauf hinweist, dass das Enzym wahrscheinlich eine wichtige Rolle spielt in oralen Biofilmen. Darüber hinaus sind weiter entfernt verwandte Homologe in pathogenen Streptokokken vorhanden, darunter S. pyogenes und die wichtigen Tierpathogene S. suis, S. equi und S. iniae (ergänzende Abbildung 6).

Die SsnA-Aktivität war in Gegenwart von Zuckern stark reduziert. Die Ergänzung mit Glucose oder glukosehaltigen Disacchariden führte zu einer vollständigen Hemmung der extrazellulären DNase-Aktivität. Stromaufwärts des ssnA-Gens befindet sich ein CRE-Sequenzmotiv und die Regulierung wurde in einer ΔccpA-Mutante aufgehoben. Daher ist es wahrscheinlich, dass CcpA auf der Ebene der Genregulation wirkt, um die Expression von ssnA in Gegenwart von Glucose zu kontrollieren. Leider wuchs die ΔccpA-Mutante in Brühenkulturen langsam und wir konnten aus der RT-qPCR-Analyse der ssnA-Expression in diesem Stamm keine reproduzierbaren Daten erhalten. Die Regulierung extrazellulärer DNase-Enzyme durch CcpA wurde bei anderen Streptokokkenarten beobachtet, darunter S. suis und S. pyogenes51,52. Bei S. gordonii wird CCR durch eine breite Palette von Zuckern ausgelöst, und wir konnten keinen Zucker identifizieren, der bei S. gordonii nicht zu CCR führt43. Tatsächlich lösen einige Zucker wie Galactose und Lactose in S. gordonii komplexe regulatorische Reaktionen aus, an denen zusätzlich zu CcpA53 mehrere Regulatoren beteiligt sind. Es ist interessant, dass Galactose die SsnA-Aktivität in einem Agarplattentest nicht reduzierte (ergänzende Abbildung 2), wohingegen es SsnA in Brühenkulturen stark unterdrückte (Abb. 3). Wir nehmen an, dass dies auf Regulationswege zurückzuführen sein könnte, die die Galacatose-gesteuerte CcpA-vermittelte Unterdrückung der ssnA-Expression auf Agarplattenkulturen kompensieren. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um die Regulierungswege zu identifizieren, die die ssnA-Expression in Biofilmen steuern.

Die Aktivität von SsnA wurde möglicherweise auch durch den pH-Wert im Wachstumsmedium beeinflusst. Der Zuckerstoffwechsel führte zu einer Ansäuerung des Wachstumsmediums auf einen pH-Wert < 5,0. Die Inkubation von Zellen bei einem ähnlich niedrigen pH-Wert führte zu einem schnellen Verlust der extrazellulären DNase-Aktivität, der erst durch die De-novo-Proteinsynthese wiederhergestellt werden konnte. DNase-I-Enzyme von Säugetieren neigen dazu, ein relativ niedriges pH-Optimum zu haben, etwa 6,5–7, während andere Mitglieder der DNase-I-Familie höhere pH-Werte bevorzugen54. Der pH-Aktivitätsbereich von rekombinantem SsnA (6,5 bis 10,5) scheint etwas höher zu sein als der des S. sanguinis-Homologen SWAN, der von pH 5,5 bis 9,0 aktiv ist, mit maximaler Aktivität bei etwa neutralem pH41. Die Inkubation von rekombinantem SsnA unter Bedingungen mit niedrigem pH-Wert führte nicht zu einer irreversiblen Inaktivierung des Enzyms, und die Aktivität wurde vollständig wiederhergestellt, als das Enzym auf einen Puffer mit höherem pH-Wert umgestellt wurde (ergänzende Abbildung 7). Daher scheint es, dass die Inaktivierung von zellwandgebundenem SsnA nach dem Wachstum in Zucker oder einem Medium mit niedrigem pH-Wert hauptsächlich auf den Proteinumsatz und nicht auf eine direkte Hemmung des Enzyms zurückzuführen ist. Dennoch ist zu beachten, dass Chloramphenicol zu einem weitgehenden Stillstand der Proteinsynthese führt, was sich indirekt auf die SsnA-Aktivität auswirken könnte, beispielsweise durch Beeinflussung des pH-Werts in Zellen und in der unmittelbaren Umgebung.

Neben dem pH-Wert sind Metallionen wichtig für die Aktivität der Enzyme der DNase-I-Familie. Beispielsweise wird die Aktivität von S. sanguinis SWAN durch Mg2+ und Ca2+41 gesteigert. In ähnlicher Weise fanden wir heraus, dass entweder Mg2+ oder Ca2+ die SsnA-Aktivität förderten. Dies legt nahe, dass SsnA eines dieser Metalle nutzen kann, anstatt beide wie SWAN oder einige andere Enzyme der DNase-I-Familie zu benötigen. Bei niedrigen Konzentrationen schienen Mn2+ und Zn2+ auch SsnA zu aktivieren. Allerdings nahm die Aktivität bei >64 μM Mn2+ oder >40 μM Zn2+ deutlich ab. In diesen Experimenten wurden niedrige Konzentrationen (40 μM) des Chelatbildners EDTA verwendet, um mit dem Enzym oder DNA-Substrat verbundene Spurenmetalle zu entfernen. Es ist möglich, dass Zn2+ Mg2+ oder Ca2+ aus dem EDTA verdrängt und so indirekt das Enzym aktiviert hat. Bei höheren Konzentrationen scheint insbesondere Zn2+ ein wirksamer Inhibitor von SsnA zu sein. Dies steht im Einklang mit anderen Enzymen der DNase I-Familie, einschließlich menschlicher DNase I, die durch Zn2+55 gehemmt werden. Andererseits spekulieren wir, dass die Abnahme der Aktivität bei höheren Mn2+-Konzentrationen durch eine signifikante Bindung von Mn2+ an das DNA-Substrat verursacht werden könnte, was die Erkennung/Interaktion des Enzyms beeinträchtigt. Die Konzentrationen von Zn2+ im Speichel liegen in der Größenordnung von 0,2–1,2 μM, während Ca2+ bei etwa 0,5–2,75 mM und Mg2+ bei 7–30 μM vorhanden ist56. Diese Konzentrationen würden möglicherweise die Aktivität von SsnA in oralen Biofilmen unterstützen.

Die Rolle extrazellulärer DNase-Enzyme bei der Vermittlung von Interspezies-Interaktionen in Streptokokken-Biofilmen wurde bisher nicht untersucht. Hier haben wir gezeigt, dass von S. mutans GS-5 gebildete Biofilme für ihre Stabilität auf eDNA angewiesen sind. Bei Kultivierung mit dem NucB-DNase-Enzym produzierte S. mutans NG8 im Vergleich zur Kontrolle (NucB fehlt) etwa 20 % der Biofilmbiomasse, wohingegen S. mutans UA159 nur auf etwa 80 % der Kontrollbiomasse reduziert wurde (ergänzende Abbildung 8). ein Niveau, das mit anderen veröffentlichten Arbeiten übereinstimmt24. Es ist nicht klar, warum einige Stämme stärker auf eDNA angewiesen sind als andere, obwohl dieses Phänomen auch bei anderen oralen Streptokokken beobachtet wurde57. Es ist zu beachten, dass einige Laborkulturen von S. mutans GS-5, einschließlich unserer eigenen, Mutationen in den pac- und gbpC-Genen tragen, die zur Sekretion des Zelloberflächenproteins PAc (Antigen I/II) und zu einer mangelnden Produktion von führen GbpC (Glucan-bindendes Protein C)58. Zukünftige Studien sind erforderlich, um festzustellen, ob PAc und/oder GbpC die Abhängigkeit von S. mutans-Biofilmen von eDNA beeinflussen.

Die Fähigkeit von SsnA, statische S. mutans GS-5-Biofilme zu zerstreuen, hing vom pH-Wert des Mediums ab. Bei pH 5,0 löste SsnA keine Biofilme auf, im Gegensatz zu DNase I, das die Anti-Biofilm-Aktivität beibehielt. Interessanterweise reduzierten SsnA und DNase I bei pH 6,0 die Biofilme auf etwa 40 % des Niveaus der Kontrollen, was darauf hindeutet, dass beide Enzyme unter diesen Bedingungen aktiv waren. Im Gegensatz dazu war rekombinantes SsnA beim Test gegen eine fluoreszierende Oligonukleotidsonde unterhalb eines pH-Werts von 6,5 nicht aktiv. Es ist möglich, dass die Umgebung innerhalb von Biofilmen den niedrigen pH-Wert59 puffert. Alternativ könnte dies auf Unterschiede in der Beschaffenheit des DNA-Substrats zurückzuführen sein. Die Fähigkeit von SsnA, S. mutans-Biofilme bei etwa pH 6,0 zu kontrollieren, kann bei Bedingungen in der Mundhöhle wichtig sein, da gezeigt wurde, dass S. mutans-Biofilme weniger Glucan enthalten und bei Kultivierung bei pH 6,0 stärker von eDNA abhängig sind als bei Wachstum bei pH 7,060. Dennoch könnte die Senkung des pH-Werts auf 5,0 oder niedriger eine Abwehrstrategie von S. mutans gegen SsnA darstellen. Es ist bemerkenswert, dass die Verfügbarkeit von Saccharose und Stärke die weitere eDNA-Freisetzung und Säureproduktion durch S. mutans stimuliert, was zur Bildung eines stabilen Biofilms führt25. Konsequenterweise wird das Wachstum von S. mutans in Biofilmen gemischter Arten, die auch S. gordonii-Biofilm enthalten, in Gegenwart von Saccharose verstärkt61,62.

Das Vorhandensein von SsnA hemmte das Wachstum oraler Mikrokosmos-Biofilme gemischter Spezies unter dem Fluss von natürlichem menschlichem Speichel, was darauf hindeutet, dass die Anti-Biofilm-Aktivität von SsnA nicht spezifisch für S. mutans-Biofilme ist. Zusätzlich zu S. mutans wurde gezeigt, dass Biofilme einzelner Arten mehrerer oraler Mikroorganismen wie S. intermedius und S. sanguinis empfindlich auf die Behandlung mit DNase-Enzymen reagieren63,64,65. Da die orale Biofilmentwicklung stark von den Zell-Zell-Interaktionen zwischen den Spezies beeinflusst wird66, spekulieren wir, dass der Ausschluss bestimmter Spezies dramatische Auswirkungen auf die Ansammlung von Zahnbelag haben könnte. Die schädlichen Auswirkungen von SsnA auf orale Biofilme gemischter Spezies stimmen mit den Ergebnissen überein, die bei der Behandlung von in situ mit DNase I32 gezüchtetem Zahnbelag erzielt wurden. Zuvor haben wir gezeigt, dass das Vorhandensein von NucB-DNase während der Entwicklung des oralen Mikrokosmos zu einer verringerten Biomasse führt67. Interessanterweise wurde auch die mikrobielle Vielfalt in oralen Biofilmen beeinflusst. Der in Gegenwart von NucB entwickelte Biofilm enthielt verringerte Anteile an anaeroben und proteolytischen Spätkolonierarten wie Peptostreptococcus, Porphyromonas und Prevotella31. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um festzustellen, ob SsnA bestimmte Arten im Biofilm selektiv hemmt.

Basierend auf unseren Erkenntnissen spekulieren wir, dass es möglich sein könnte, die Expression von Streptokokken-DNasen wie SsnA gezielt zu steuern, um das Wachstum von Zahnbelag zu kontrollieren. Allerdings könnte die Hemmung von SsnA durch einen niedrigen pH-Wert die Entwicklung dieser Strategie gegen kariogene Biofilme einschränken. Wir stellen fest, dass SsnA das Biofilmwachstum in mit Saccharose angereichertem Speichel nicht wirksam kontrollieren konnte, was möglicherweise auf die Säureproduktion durch Mikroorganismen im Biofilm zurückzuführen ist. Die Produktion von Glucanen, die mit DNA interagieren und die Matrix68 stabilisieren können, könnte ebenfalls zur mangelnden Aktivität von SsnA unter diesen Bedingungen beigetragen haben. Weitere Studien, die darauf abzielen, die regulatorischen Mechanismen zu verstehen, die die Produktion und Aktivität von SsnA steuern, sowie die Auswirkungen oraler mikrobieller extrazellulärer DNasen auf die Struktur und mikrobielle Zusammensetzung von Zahnbelag, könnten zur Entwicklung neuer Ansätze zur Kontrolle von Multispezies-Biofilmen führen, indem sie auf die extrazelluläre Matrix abzielen .

Streptococcus gordonii DL1 (Challis), Staphylococcus aureus FH7 und Streptococcus mutans GS-5 (Ergänzungstabelle 1) wurden routinemäßig in BHY-Medium (Brain Heart Infusion 37 g/L und 5 g/L Hefeextrakt) bei 37 °C anaerob (10) kultiviert % CO2, 10 % H2 und 80 % N2 in einer Ruskinn BugBox Plus, Ruskinn Technology Ltd, Bridgend, UK). Als festes Medium wurde BHY-Agar (BHY-Medium plus 15 g/L Bacto-Agar) verwendet. Bei Bedarf wurden folgende Antibiotika eingesetzt: Kanamycin (250 μg/ml), Spectinomycin (250 μg/ml) und Erythromycin (10 μg/ml für chromosomale Insertionen und 2 μg/ml für Plasmide). Escherichia coli wurde in Lysogeny Broth (Melford Laboratories, Ipswich, UK) bei 37 °C unter Schütteln mit 200 U/min kultiviert.

Intrazelluläre DNA (iDNA) oder extrazelluläre DNA (eDNA) wurde wie von Kreth et al.21 beschrieben extrahiert. S. gordonii oder S. mutans wurden über Nacht in TYEG-Medium kultiviert, das 10 g Bacto-Trypton, 5 g Hefeextrakt, 3 g K2HPO4 und 2 g Glucose pro Liter enthielt und auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt war. Insgesamt 10 µL wurden in 2 ml frisches TYEG in Vertiefungen einer Plastikschale mit 12 Vertiefungen überführt und die Kulturen wurden unter leichtem Schütteln (20 U/min) 72 Stunden lang inkubiert, wobei das Medium alle 24 Stunden gewechselt wurde. Der Überstand wurde abgesaugt und die Vertiefungen wurden zweimal mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, gewaschen. Nach dem Absaugen der Flüssigkeit wurden weitere 1,5 ml PBS in eine Vertiefung gegeben und der Biofilm durch vorsichtiges Abschaben mit einem Gewebekulturschaber geerntet. Um ausreichend Biomasse für die DNA-Extraktion bereitzustellen, wurde diese Probe in eine entsprechende Vertiefung überführt und zusätzlicher Biofilm abgekratzt. Insgesamt wurden für jede Probe Biofilme aus vier Vertiefungen kombiniert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 12.000 g, 4 °C, 30 Minuten geerntet und der Überstand (eDNA-Probe) und das Pellet (enthaltend Zellen mit iDNA) wurden bis zur weiteren Reinigung bei –20 °C gelagert.

Zur Reinigung der eDNA wurde ein gleiches Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol im Verhältnis 25:24:1 zugegeben und durch 30–40-maliges Umdrehen gemischt. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 16.000 g und 4 °C wurde die wässrige Phase gesammelt und die Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol-Extraktion wiederholt. Nach einer weiteren Zentrifugation wurde die wässrige Phase gesammelt und die DNA durch Zugabe eines Zehntelvolumens 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und Mischen ausgefällt. Zwei Drittel des Volumens Isopropanol wurden zugegeben und gemischt, und die eDNA wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 16.000 g und 4 °C pelletiert. Nach dem Waschen mit 1 ml 100 % Ethanol wurde das Pellet an der Luft getrocknet und in 20 µL 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, resuspendiert.

Um iDNA zu extrahieren, wurden Zellpellets in 150 µL Sphäroplastpuffer (20 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2 und 26 % (w/v) Raffinose, eingestellt auf pH 6,8) resuspendiert. Dazu wurden 1,5 µL Lysozym aus einer 250 µg mL-1-Stammlösung und 5 µL Mutanolysin aus einer 10.000 U mL-1-Stammlösung zugegeben und die Proben 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zugabe von 150 µL T&C-Lyselösung mit 1 µL Proteinase K (Epicentre MasterPure DNA Purification Kit, Epicenter Biotechnologies, Madison, WI, USA) lysiert und die DNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert.

Um potenzielle Homologe der DNase-I-Familie in S. gordonii zu identifizieren, wurde die DNase-I-Domänen-Superfamilie in der Superfamily-Datenbank identifiziert (https://supfam.mrc-lmb.cam.ac.uk/SUPERFAMILY/cgi-bin/scop.cgi? sunid=56219). Mitglieder der DNase I-Familie von S. gordonii wurden unter „Genomzuordnungen“ identifiziert. Das ssnA-Gen und die Promotorregion wurden aus dem Genom von S. gordonii Challis (GenBank-Zugang CP000725.1) entnommen. Mutmaßliche Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren wurden mithilfe von PePPER69 identifiziert.

Bakterien wurden in 200 μl Medien dreifach in Platten mit 96 Vertiefungen aus Polystyrol inokuliert. Die Platten wurden 20 Stunden lang anaerob bei 37 °C inkubiert. Bei der Durchführung von Biofilm-Hemmungstests wurde Rinder-DNase I oder GST-SsnA (5 µg/ml) zum Zeitpunkt der Inokulation hinzugefügt. Für Ausbreitungstests wurden Enzyme (5 µg/ml) zu 20 Stunden alten Biofilmen hinzugefügt und eine weitere Stunde bei 37 °C inkubiert. Das Ausmaß des Biofilms wurde mithilfe des Kristallviolett-Assays quantifiziert57. Biofilmtests wurden dreimal unabhängig voneinander wiederholt. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Absorptionsmesswerten wurde durch den Student-T-Test mit zwei Proben bestimmt.

Eine Oligonukleotidsonde, 5′ HEX-CCC CGG ATC CAC CCC-BHQ2 3′ (PrimeTime probe Integrated DNA Technologies), wurde zur Quantifizierung der DNase-Aktivität verwendet, wie von Kiedrowski et al.70 beschrieben. Die Sonde (2 μM der Sonde in einem Puffer bestehend aus 20 mM Tris-HCl, pH 8) wurde zu 25 μL einer Nukleasequelle (Zellen oder gereinigtes Enzym) in einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen (Greiner Bio-) hinzugefügt. One, Stonehouse, UK) und die Geschwindigkeit der Fluoreszenzänderung (λex: 530 nm, λem: 590 nm) wurden bei 37 °C über 30 Minuten mit dem Mikroplattenlesegerät Synergy HT (BioTek, Swindon, UK) gemessen.

Die Störung von ssnA erfolgte durch Ersetzen des chromosomalen ssnA durch die Spectinomycin-Resistenzdeterminante aad9. Flankierende Regionen des ssnA-Gens wurden mittels PCR unter Verwendung der Primer SsnAF1 und SsnAR1 amplifiziert, um ein 484-bp-Produkt in der 5'-Region von ssnA zu erzeugen, und SsnAF2 und SsnAR2, um ein 674-bp-Produkt am 3'-Ende von ssnA zu erzeugen. Das aad9-Gen (782 bp) wurde aus dem Plasmid pFW5 (Ergänzungstabelle 1) mit den Primern aad9_SsnAF und aad9_SsnAR amplifiziert. Diese PCR-Reaktionen wurden mit Taq Reddymix (Sigma Aldrich, Gillingham, UK) und Zyklusbedingungen von 94 °C, 2 Minuten, 35 Zyklen von 94 °C für 10 Sekunden, 56 °C für 30 Sekunden, 68 °C für 90 Sekunden durchgeführt , dann 7 Min. bei 68 °C und bei 4 °C halten. Die PCR-Produkte wurden in äquimolaren Verhältnissen gemischt und in einer Overlap-Extension-PCR unter Verwendung der Primer SsnAF1 und SsnAR2 mit dem Expand Long Range PCR-Enzymmix (Sigma Aldrich) amplifiziert. Der Thermozyklus wurde wie folgt durchgeführt: 92 °C, 2 Min., 10 Zyklen von 92 °C, 10 s, 56 °C, 15 s, 68 °C 150 s, 25 Zyklen von 92 °C, 10 s, 56 °C, 15 s, 68 °C 150 s und Erhöhung um 20 s pro Zyklus, dann 68 °C für 7 min und 4 °C halten. Das resultierende Produkt wurde zur Transformation von S. gordonii DL1 verwendet. Zu diesem Zweck wurde S. gordonii in einem Kerzenglas bis zur frühen exponentiellen Phase (OD600 nm ~ 0,3) in BHY-Medium, ergänzt mit 1 µL mL-1 fötalem Kälberserum und 0,1 % (w/v) Glucose (BHY/FCS/G), kultiviert ). Nach weiteren 60 Minuten bei 37 °C wurden die Kulturen in 0,8-ml-Aliquots verteilt und etwa 1 µg des PCR-Produkts hinzugefügt. Nach weiteren 4 Stunden Inkubation wurden die Kulturen verdünnt und 36 Stunden lang in einem Kerzenglas auf verfestigtem BHY-Medium kultiviert. Die erfolgreiche Unterbrechung und Ersetzung des ssnA-Gens durch das aad9-Gen wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

Die Zerstörung von ccpA wurde mit einem ähnlichen Ansatz durchgeführt, indem ccpA durch das kanR-Kanamycin-Resistenzgen ersetzt wurde. Die Upstream-Region von ccpA wurde mit CcpAF1 und CcpAR1 amplifiziert, wodurch ein 520-bp-Fragment entstand, und die Downstream-Region von ccpA wurde mit CcpAF2 und CcpAR2 amplifiziert. Das kanR-Gen wurde mit KanR_F- und KanR_R-Primern unter Verwendung des pK18-Vektors (Ergänzungstabelle 1) als Matrize amplifiziert. Gibson Assembly Master Mix (New England BioLabs, Ipswich, Massachusetts, USA) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers zur Fusion der Upstream- und Downstream-Fragmente von ccpA mit dem kanR-Gen verwendet. Das resultierende 1.795-bp-Fragment wurde zur Transformation von S. gordonii-Zellen verwendet. Die erfolgreiche Unterbrechung und Ersetzung des ccpA-Gens durch das kanR-Gen wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

Die Mutagenese des malR-Gens wurde durch Ersetzen von malR durch die ermAM-Erythromycin-Resistenzkassette erreicht. Unter Verwendung der Primer malRF1 und malRR1 wurde ein 471-bp-Fragment stromaufwärts des malR-Gens amplifiziert. malRF2 und malRR2 wurden verwendet, um eine 421-bp-Sequenz-Downstream-Region des malR-Gens zu amplifizieren. Die malRR1- und malRF2-Primer enthielten 17-bp-komplementäre Sequenzen für die ermAMF2- und ermAMR2-Primer. Nach der Amplifikation der ermAM-Kassette aus pVA838 (Ergänzungstabelle 1) wurden die PCR-Produkte in einer Overlap-Extension-PCR zusammengefügt. Das resultierende Produkt wurde zur Transformation von S. gordonii DL1 verwendet.

Zur Genkomplementierung wurde das Plasmid pssnAComp durch Amplifikation von ssnA unter Verwendung der Primer SsnA.compF und SsnA.compR und genomischer DNA aus Wildtyp-S. gordonii DL1 als Matrize erstellt. Die Primer SsnA.compF und SsnA.compR enthielten EcoRI- bzw. BamHI-Restriktionsenzymstellen. Das Amplikon wurde mit BamHI und EcoRI verdaut und in den pDL276-Vektor (Ergänzungstabelle 1) ligiert, der ebenfalls mit BamHI und EcoRI (New England BioLabs) verdaut worden war. Die erfolgreiche Konstruktion von pssnAComp wurde durch Sequenzierung bestätigt und zur Transformation des S. gordonii ΔssnA-Mutanten verwendet, um den genetisch komplementierten Stamm S. gordonii ssnAComp zu erzeugen.

Das Plasmid pccpAComp wurde durch Ersetzen des arcR-Gens in parcRComp71 durch das ccpA-Gen erzeugt. Die Primer CcpA_compF und CcpA_compR wurden verwendet, um das ccpA-Gen unter Verwendung von genomischer Wildtyp-DNA von S. gordonii als Matrize zu amplifizieren, wodurch ein 1048-bp-Fragment entstand. Lin-vecF- und Lin-vecR-Primer wurden verwendet, um einen linearisierten Vektor unter Verwendung des parcRComp-Plasmids als Matrize zu erstellen, wodurch ein linearer Vektor mit 5797 bp entstand. Das In-Fusion HD PCR-Ligationsklonierungskit (Clontech Laboratories, Mountain View, Kalifornien, USA) wurde verwendet, um das ccpA-Fragment mit dem Vektorrückgrat zu fusionieren und pccpAComp zu erzeugen. Die Integrität des Plasmids pccpAComp wurde durch Sequenzierung bestätigt und pccpAComp wurde zur Transformation von S. gordonii ΔccpA verwendet, um S. gordonii ccpAComp zu erzeugen.

Routinemäßige genetische Manipulationen wurden unter Verwendung der von Sambrook et al.72 beschriebenen und unten erläuterten Protokolle durchgeführt. Plasmide und Primer sind in der Ergänzungstabelle 1 und der Ergänzungstabelle 2 beschrieben.

SsnA wurde als Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionskonstrukt kloniert. Das GST-Tag wurde an den erforderlichen Stellen gespalten. Das ssnA-Gen, abzüglich des C-terminalen LPxTG-Zellankermotivs und der N-terminalen Sekretionssignaldomäne, wurde unter Verwendung der Primer ssnA_Pf7 und ssnA_Pr7 amplifiziert, wodurch ein Produkt von 2150 bp entstand. Dieses Produkt wurde in das pGEX-KT-Plasmid (Ergänzungstabelle 1) kloniert und in E. coli DH5α transformiert. Zur Transformation wurden chemisch kompetente E. coli-Zellen hergestellt, indem E. coli bis zur frühen exponentiellen Phase (OD600 nm ~ 0,3) in 50 ml LB kultiviert, 5 Minuten lang bei 5000 U/min geerntet und das Pellet in 20 ml eiskaltem 50 mM CaCl2 suspendiert wurde . Nach 20-minütigem Stehen auf Eis wurden die Zellen durch 5-minütige Zentrifugation bei 5000 U/min und 4 °C geerntet und in 4 ml eiskaltem CaCl2 suspendiert. Die Proben wurden in 300-µL-Portionen verteilt, DNA wurde hinzugefügt und 40 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden 2 Minuten lang einem Hitzeschock bei 42 °C ausgesetzt und dann in Eis getaucht. Transformanten wurden durch Zugabe von 500 µL vorgewärmtem SOC-Medium, das 20 g L-1 Bactotrypton, 5 g L-1 Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 und 20 mM Glucose enthielt, gewonnen 1 Stunde lang bei 37 °C und 250 U/min inkubieren, bevor es auf selektiven LB-Agarplatten verteilt wird. Das pGEX-ssnA-Plasmid wurde dann auf E. coli BL21 (DE3) pLysS (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA) übertragen. Die Expression von GST-SsnA wurde durch 1 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (Sigma Aldrich) für 4 Stunden bei 37 °C induziert. Eine Glutathion-Sepharose-Säule wurde verwendet, um GST-SsnA in 10 mM Glutathion, 50 mM Kaliumphosphat, pH 7,2, 1 mM DTT (Sigma Aldrich) zu eluieren. SDS-PAGE und Coomassie Brilliant Blue-Färbung sowie Zymographie wurden durchgeführt, um die Größe und Aktivität von gereinigtem GST-SsnA zu bestimmen.

Der N-terminale 26-kDa-GST-Protein-Tag wurde durch Thrombin gespalten. Gereinigtes SsnA wurde vom Elutionspuffer gegen TNC-Puffer (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 50 mM NaCl und 1 mM CaCl2) ausgetauscht, um eine optimale Spaltung des GST-Tags zu erreichen. Die Proben wurden 24 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 1 U Rinderthrombin (Sigma) pro 0,025 mg SsnA inkubiert. Thrombin wurde durch Zugabe von 0,3 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) inaktiviert und 15 Minuten bei 37 °C inkubiert.

Für das Wachstum von Mikrokosmos-Biofilmen gemischter Spezies wurde Speichel von gesunden Freiwilligen gesammelt, die in der letzten Stunde weder gegessen noch getrunken (außer Wasser) und in den letzten drei Wochen keine Antibiotika eingenommen hatten. Die ethische Genehmigung für die Speichelsammlung wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Newcastle erteilt (Ref. 1853/519/2020). Bei Bedarf wurde der Speichel mit Dithiothreitol behandelt, Niederschläge durch Zentrifugation entfernt und der Speichel durch Filtration sterilisiert, um zellfreien Speichel (CFS) zu erzeugen73. Der BioFlux 1000 (Fluxion, San Francisco, CA) wurde zur Züchtung oraler Mikrokosmos-Biofilme gemischter Arten eingesetzt. Vor der Inokulation wurden Kanäle von BioFlux-Dual-Flow-24-Well-Platten (Fluxion) durch Zugabe von 200 μl zellfreiem Speichel (CFS) und 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur vorbereitet. Anschließend wurde überschüssiges CFS aus der Auslassvertiefung entfernt und durch 100 μl unbehandelten Speichel ersetzt. Der Fluss wurde 6 s lang mit 1,0 dyn/cm2 vom Auslass zum Einlass eingeleitet. Anschließend wurde die Platte 40 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, um die Aussaat zu ermöglichen. Jeder der Einlassbrunnen wurde dann mit vorgewärmtem (auf 37 °C) CFS gefüllt und der Fluss wurde mit 0,5 dyn/cm2 bei 37 °C für 18 Stunden eingeleitet und alle 10 Minuten wurden Bilder aufgenommen. Bei Bedarf wurde CFS in den Einlassbrunnen mit 2 % Saccharose oder DNase-Enzymen ergänzt. Die verwendeten DNase-Enzyme waren Rinder-DNase I (Sigma Aldrich), Bacillus licheniformis NucB67 und S. gordonii SsnA. Sie wurden in einer Konzentration von 5 μM in die Einlässe gegeben. Zur Visualisierung der eDNA wurde in beide Einlassvertiefungen 2,4 nM Yoyo-1-Farbstoff (LifeTechnologies) mit CFS eingearbeitet.

Die Bildgebung von im BioFlux 1000 gezüchteten Biofilmen wurde mit der BioFlux 1000Z Imaging Workstation durchgeführt, die aus einem Zeiss Axio Observer Z1-Mikroskop mit einem Umgebungsgehäuse bestand. Für die Bildaufnahme wurden eine Hamamatsu-Kamera (ORCA-Flash 4.0 LT: 4,2 Megapixel mit 6,5 Mikron Pixel) und die BioFlux Montage Software (Fluxion) verwendet. Die Bilder wurden mit ImageJ v.1.48 (National Institutes of Health)74 analysiert.

Zeitrafferbilder jedes Kanals wurden in einen Stapel umgewandelt. Jeder Stapel wurde mithilfe des „Otsu“-Algorithmus automatisch mit einem Schwellenwert versehen. Ein Rechteck von w = 1000 h = 200 Pixel (Archivbildgröße 1024 × 1024 Pixel) wurde ausgewählt und als Region of Interest (ROI) gespeichert. Die durchschnittliche Pixelintensität (mittlerer Grauwert) wurde für jede Schicht gemessen und mit der Software SigmaPlot 13.0 (Systat Software, San Jose, CA, USA) aufgezeichnet.

Zur Visualisierung statischer Biofilme mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) wurden gefärbte Deckgläser mit PBS gespült und auf einen mit PBS gefüllten Gummirahmen umgedreht, der auf einem Objektträger befestigt war. Die Bildgebung wurde mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Nikon A1R durchgeführt, das mit einem CFI PLAN APO VC-Objektiv (Nikon 60x/1,40 Oil) ausgestattet war. Die Bilder wurden mit der Software NIS-Elements C (v4.4, Nikon) aufgenommen und mit der Software Imaris (v8.2, Bitplane) verarbeitet.

Die extrazelluläre DNase-Aktivität von S. gordonii wurde unter Verwendung von DNase-Testagar (Sigma Aldrich, Gillingham, UK) bewertet. Bakterienkulturen wurden auf DNase-Testagar ausgestrichen oder getüpfelt (10 µl) und 48 Stunden lang bei 37 °C aerob inkubiert. Die DNA im DNase-Testagar wurde durch Fluten der Platte mit 1 N HCl ausgefällt.

Um die Nukleaseaktivität von Bakterienkulturen zu bestimmen, wurden Übernachtkulturen zweimal mit PBS bei pH 7,1 gewaschen und in PBS auf eine optische Dichte von OD600 nm = 1 resuspendiert. Anschließend wurde die DNase-Aktivität für 25 µL der Zellsuspension mit dem Synergy HT gemessen Mikroplatten-Reader (BioTek). Für Experimente zur Bestimmung der Wiederherstellung der DNase-Aktivität nach Inkubation bei niedrigem pH-Wert wurden über Nacht Kulturen von S. gordonii DL1-Zellen, die in THYE-Medium bei 37 °C gezüchtet wurden, geerntet und in einem Puffer mit pH 4,5 (77,1 g/L Ammoniumacetat, 70 ml/L Eisessig), ein Puffer mit pH-Wert 5,5 (96,3 ml Lösung I [13,61 g/L KH2PO4 (BDH)] und 3,6 ml Lösung II [35,81 g/L Na2HPO4]) und PBS (pH 7,1). Die Zellen wurden bis zu 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, in PBS gewaschen, in frischem PBS resuspendiert und 25-µL-Aliquots wurden mithilfe des fluoreszenzbasierten DNase-Aktivitätstests auf DNase-Aktivität untersucht. Nach 2 Stunden wurden die Zellen geerntet und in PBS bei pH 7,1 gewaschen. Kulturen, die in sauren Puffern (pH 4,5 oder 5,5) inkubiert wurden, wurden vor der Ernte in gleiche Teile aufgeteilt. Ein Teil wurde in PBS resuspendiert, während der andere in PBS mit 12,5 µg/ml Chloramphenicol resuspendiert wurde, um die De-novo-Synthese von Proteinen zu hemmen75. Die Kulturen wurden bis zu weitere 2 Stunden lang inkubiert, bevor die DNase-Aktivität gemessen wurde.

Bei der Untersuchung der Aktivität von gereinigtem SsnA in Gegenwart von Metallen wurden 40 µM EDTA in die Reaktionen einbezogen, um restliche Metallverunreinigungen des Puffers oder assoziiert mit dem DNA-Substrat vor der Zugabe des mutmaßlichen Metall-Cofaktors zu chelatisieren. Als dieser Assay zur Bestimmung des optimalen pH-Werts für die SsnA-Enzymaktivität eingesetzt wurde, wurden die folgenden Puffer verwendet: Natriumacetat-Trihydrat-Puffer (pH 4,5–5,5), Bis-Tris (pH 6,0–6,5), Tris-HCl (pH 7,0–9,0). ) und 3-Cyclohexylamino-1-propansulfonsäurepuffer (pH 9,7–11,0) (Sigma Aldrich).

Zymographie wurde verwendet, um die Aktivität von gereinigtem SsnA mit oder ohne GST-Tag gegenüber doppelsträngiger DNA zu bewerten. Enzyme in Laemmli-Puffer wurden (ohne Kochen) auf 12 % SDS-PAGE-Gele geladen, die 100 μg/ml Lachssperma-DNA (Sigma Aldrich) enthielten. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in einem Enzymreaktivierungspuffer (40 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, 5 mM MgCl2 und 3 % delipidiertes Milchpulver [Premier International Foods, St. Albans, UK]) 20 Stunden lang bei 37 °C inkubiert C. Das Gel wurde 30 Minuten lang mit Ethidiumbromid (0,5 μg mL−1) gefärbt und dreimal jeweils 15 Minuten lang in destilliertem Wasser gewaschen. Das Gel wurde unter ultraviolettem Licht mit einem G:BOX-Transilluminator (Syngene) sichtbar gemacht.

Vier ml Zellkultur wurden mit 4 ml RNAlater (Life Technologies) gemischt, und die Röhrchen wurden 5 Sekunden lang vortexiert und 5 Minuten lang bei 20 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen bei 3800 g für 15 Minuten bei 20 °C geerntet, der Überstand wurde verworfen und die Pellets wurden bei –80 °C für nicht länger als 72 Stunden eingefroren und die RNA wurde extrahiert76. Die Proben wurden bei 20 °C aufgetaut und in 100 μl Spheroplastpuffer plus Mutanolysin bei 500 U/ml resuspendiert. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 37 ° C inkubiert. Die Gesamt-RNA wurde mit dem Ambion RiboPure Bacteria RNA Purification Kit (Life Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die RNA-Konzentrationen wurden mit einem NanoDrop ND-1000-Spektrophotometer (Nanodrop Technologies, LLC, Wilmington, DE, USA) bestimmt. Die RNA wurde mittels Gelelektrophorese analysiert, um die Integrität der RNA sicherzustellen. Ein μg Gesamt-RNA aus Bakterienzellen wurde mit dem QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers revers transkribiert.

Es wurden RT-qPCR-Reaktionsmischungen hergestellt, die 0,25 μl cDNA-Proben und QuantiTect SYBR Green Mix (Qiagen), 1 μM Vorwärtsprimer qRT-ssnAF und qRT-ssnAR-Rückwärtsprimer (Ergänzungstabelle 2) in einem Gesamtvolumen von 20 μl enthielten. Die Reaktionen wurden dreifach unter Verwendung von QuantStudio 3 (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) mit dem folgenden Thermocycling-Programm durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 2 Minuten und 40 Amplifikationszyklen bei 95 °C für 15 Sekunden, 55 °C für 10 s und 72 °C für 30 s. Die vergleichende CT-Methode (ΔΔCT) wurde zur Analyse der RT-qPCR-Daten verwendet und die Daten wurden auf das 16 S-rRNA-Gen als Referenz normalisiert (Ergänzungstabelle 2, qRT-16S-F und qRT-16S-F). RT-qPCR-Reaktionen wurden mittels Schmelzkurvenanalyse validiert.

Alle Diagramme wurden gezeichnet und statistische Tests wurden mit GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornien, USA) Version 9 durchgeführt. Einzelheiten zu statistischen Tests sind in den Legenden der Abbildungen angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Quantitative Daten, die den Zahlen im Hauptmanuskript zugrunde liegen, sind im Newcastle University Research Repository verfügbar (https://doi.org/10.25405/data.ncl.21539340). Weitere Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Bik, EM et al. Bakterienvielfalt in der Mundhöhle von 10 gesunden Personen. ISME J. 4, 962–974 (2010).

Artikel Google Scholar

Huang, R., Li, M. & Gregory, RL Bakterielle Interaktionen im Zahnbiofilm. Virulence 2, 435–444 (2011).

Artikel Google Scholar

Jakubovics, NS Intermikrobielle Interaktionen als Treiber für die Zusammensetzung und Schichtung oraler Biofilme in der Gemeinschaft. J. Mol. Biol. 427, 3662–3675 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Hajishengallis, G. & Lamont, RJ Jenseits des roten Komplexes und hin zu mehr Komplexität: das polymikrobielle Synergie- und Dysbiose-Modell (PSD) der Ätiologie parodontaler Erkrankungen. Mol. Oral. Mikrobiol. 27, 409–419 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Diaz, PI & Valm, AM Mikrobielle Interaktionen in oralen Gemeinschaften vermitteln entstehende Biofilmeigenschaften. J. Dent. Res. 99, 18–25 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Zijnge, V. et al. Orale Biofilmarchitektur auf natürlichen Zähnen. PLoS ONE 5, e9321 (2010).

Artikel Google Scholar

Kolenbrander, PE et al. Kommunikation zwischen oralen Bakterien. Mikrobiol. Mol. Biol. Rev. 66, 486–505 (2002).

Artikel CAS Google Scholar

Mann, EE et al. Die Modulation der eDNA-Freisetzung und des Abbaus beeinflusst die Reifung des Staphylococcus aureus-Biofilms. PLoS ONE 4, e5822 (2009).

Artikel Google Scholar

Nascimento, MM et al. Die Wirkung von Arginin auf orale Biofilmgemeinschaften. Mol. Oral. Mikrobiol. 29, 45–54 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Belda-Ferre, P. et al. Das orale Metagenom in Gesundheit und Krankheit. ISME J. 6, 46–56 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Marsh, PD Mikrobiologie von Zahnbelag-Biofilmen und ihre Rolle für die Mundgesundheit und Karies. Delle. Klin. North Am. 54, 441–454 (2010).

Artikel Google Scholar

Vos, T. et al. Globale, regionale und nationale Inzidenz, Prävalenz und Jahre mit Behinderungen für 328 Krankheiten und Verletzungen für 195 Länder, 1990–2016: eine systematische Analyse für die Global Burden of Disease Study 2016. Lancet 390, 1211–1259 (2017).

Artikel Google Scholar

Marsh, PD Mikrobielle Ökologie von Zahnbelag und seine Bedeutung für Gesundheit und Krankheit. Adv. Delle. Res. 8, 263–271 (1994).

Artikel CAS Google Scholar

Marsh, PD & Zaura, E. Zahnbiofilm: ökologische Wechselwirkungen bei Gesundheit und Krankheit. J. Clin. Parodontologie. 44 (Ergänzung 18), S12–S22 (2017).

Artikel Google Scholar

Simón-Soro, A. & Mira, A. Lösung der Ätiologie von Zahnkaries. Trends Mikrobiol. 23, 76–82 (2015).

Artikel Google Scholar

Serrage, HJ, Jepson, MA, Rostami, N., Jakubovics, NS & Nobbs, AH Die Matrix verstehen: Die Rolle der extrazellulären DNA in oralen Biofilmen. Front Oral Health 2, https://doi.org/10.3389/froh.2021.640129 (2021).

Liu, Y.-L., Nascimento, M. & Burne, RA Fortschritte beim Verständnis des Beitrags der Alkalibildung in Zahnbiofilmen zur Hemmung von Zahnkaries. Int. J. Oral. Wissenschaft. 4, 135–140 (2012).

Artikel Google Scholar

Jakubovics, NS et al. Entscheidende Rollen von Arginin beim Wachstum und der Biofilmentwicklung von Streptococcus gordonii. Mol. Mikrobiol. 97, 281–300 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Nascimento, MM et al. Der orale Argininstoffwechsel kann das Risiko für Zahnkaries bei Kindern verringern. J. Dent. Res. 92, 604–608 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Huang, X., Schulte, RM, Burne, RA & Nascimento, MM Die Charakterisierung der arginolytischen Mikroflora liefert Einblicke in die pH-Homöostase in menschlichen oralen Biofilmen. Kariesres. 49, 165–176 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Kreth, J., Zhang, Y. & Herzberg, MC Streptokokken-Antagonismus in oralen Biofilmen: Interferenz von Streptococcus sanguinis und Streptococcus gordonii mit Streptococcus mutans. J. Bakteriol. 190, 4632–4640 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Firestone, AR, Schmid, R. & Mühlemann, HR Kariogene Wirkungen von gekochter Weizenstärke allein oder mit Saccharose und frequenzkontrollierter Fütterung bei Ratten. Bogen. Oral. Biol. 27, 759–763 (1982).

Artikel CAS Google Scholar

Liao, S. et al. Die extrazelluläre DNA von Streptococcus mutans wird während des Wachstums in Biofilmen hochreguliert, aktiv über Membranvesikel freigesetzt und durch Komponenten der Proteinsekretionsmaschinerie beeinflusst. J. Bakteriol. 196, 2355–2366 (2014).

Artikel Google Scholar

Perry, JA, Cvitkovitch, DG & Lévesque, CM Zelltod in Biofilmen von Streptococcus mutans: eine Verbindung zwischen CSP und extrazellulärer DNA. FEMS Mikrobiol. Lette. 299, 261–266 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Klein, MI et al. Dynamik des Transkriptoms von Streptococcus mutans als Reaktion auf Stärke und Saccharose während der Biofilmentwicklung. PLoS ONE 5, e13478 (2010).

Artikel Google Scholar

Muto, Y. & Goto, S. Transformation durch extrazelluläre DNA, produziert von Pseudomonas aeruginosa. FEMS Mikrobiol. Immunol. 30, 621–628 (1986).

Artikel CAS Google Scholar

Jakubovics, NS, Shields, RC, Rajarajan, N. & Burgess, JG Leben nach dem Tod: die entscheidende Rolle extrazellulärer DNA in mikrobiellen Biofilmen. Lette. Appl. Mikrobiol. 57, 467–475 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Whitchurch, CB, Tolker-Nielsen, T., Ragas, PC & Mattick, JS Extrazelluläre DNA, die für die Bildung von bakteriellem Biofilm erforderlich ist. Wissenschaft 295, 1487 (2002).

Artikel CAS Google Scholar

Flemming, H.-C. & Wingender, J. Die Biofilmmatrix. Nat. Rev. Microbiol. 8, 623–633 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Dragoš, A. & Kovács, Á. T. Die besonderen Funktionen der bakteriellen extrazellulären Matrix. Trends Mikrobiol. 25, 257–266 (2017).

Artikel Google Scholar

Rostami, N. et al. Eine entscheidende Rolle für extrazelluläre DNA bei der Bildung von Zahnbelag. J. Dent. Res. 96, 208–216 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Schlafer, S., Meyer, RL, Dige, I. & Regina, VR Extrazelluläre DNA trägt zur Stabilität des Zahnbiofilms bei. Kariesres. 51, 436–442 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Porschen, RK & Sonntag, S. Extrazelluläre Desoxyribonuklease-Produktion durch anaerobe Bakterien. Appl. Mikrobiol. 27, 1031–1033 (1974).

Artikel CAS Google Scholar

Palmer, LJ, Chapple, ILC, Wright, HJ, Roberts, A. & Cooper, PR Extrazelluläre Desoxyribonukleaseproduktion durch parodontale Bakterien. J. Parodontal Res. 47, 439–445 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Mulcahy, H., Charron-Mazenod, L. & Lewenza, S. Extrazelluläre DNA chelatiert Kationen und induziert Antibiotikaresistenz in Pseudomonas aeruginosa-Biofilmen. PLoS Pathog. 4, e1000213 (2008).

Artikel Google Scholar

Mulcahy, H., Charron-Mazenod, L. & Lewenza, S. Pseudomonas aeruginosa produziert eine extrazelluläre Desoxyribonuklease, die für die Nutzung von DNA als Nährstoffquelle erforderlich ist. Umgebung. Mikrobiol. 12, 1621–1629 (2010).

Binnenkade, L., Kreienbaum, M. & Thormann, KM Charakterisierung von ExeM, einer extrazellulären Nuklease von Shewanella oneidensis MR-1. Vorderseite. Mikrobiol. 9, 1761 (2018).

Hannan, S. et al. Übertragung von Antibiotikaresistenzen durch Transformation mit eDNA in oralen Biofilmen. FEMS Immunol. Med. Mikrobiol. 59, 345–349 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Sumby, P. et al. Extrazelluläre Desoxyribonuklease, hergestellt von Streptokokken der Gruppe A, unterstützt die Pathogenese, indem sie die Umgehung der angeborenen Immunantwort verstärkt. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 102, 1679–1684 (2005).

Artikel CAS Google Scholar

Berends, ET et al. Die Nukleaseexpression durch Staphylococcus aureus erleichtert das Entkommen aus extrazellulären Neutrophilenfallen. J. Angeborenes Immunsystem. 2, 576–586 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Morita, C. et al. Zellwandverankerte Nuklease von Streptococcus sanguinis trägt dazu bei, der durch die extrazelluläre Falle von Neutrophilen vermittelten bakteriziden Aktivität zu entgehen. PLoS ONE 9, e103125 (2014).

Artikel Google Scholar

Fontaine, MC, Perez-Casal, J. & Willson, PJ Untersuchung einer neuartigen DNase von Streptococcus suis Serotyp 2. Infect. Immun. 72, 774–781 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Tong, H., Zeng, L. & Burne, RA Die EIIABMan-Phosphotransferase-Systempermease reguliert die Unterdrückung des Kohlenhydratkataboliten in Streptococcus gordonii. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 77, 1957–1965 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Yang, W. Nukleasen: Vielfalt von Struktur, Funktion und Mechanismus. Q. Rev. Biophys. 44, 1–93 (2011).

Artikel Google Scholar

Podbielski, A., Zarges, I., Flosdorff, A. & Weber-Heynemann, J. Molekulare Charakterisierung eines Streptokokken-DNase-Gens (sdaD) des Hauptserotyps M49 der Gruppe A. Infizieren. Immun. 64, 5349–5356 (1996).

Sriskandan, S., Unnikrishnan, M., Krausz, T. & Cohen, J. Mitogener Faktor (MF) ist die Haupt-DNase des Serotyps M89 Streptococcus pyogenes. Microbiology 146, 2785–2792 (2000).

Artikel CAS Google Scholar

Remmington, A. & Turner, CE Die DNasen pathogener Lancefield-Streptokokken. Mikrobiologie 164, 242–250 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Liu, J. et al. Eine Nuklease aus Streptococcus mutans erleichtert die Ausbreitung des Biofilms und die Flucht vor der Abtötung durch extrazelluläre Neutrophilenfallen. Vorderzellinfektion. Microbiol 7, 97 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Dlakić, M. Funktionell nicht verwandte Signalproteine ​​enthalten eine Faltung ähnlich Mg2+-abhängigen Endonukleasen. Trends Biochem. Wissenschaft. 25, 272–273 (2000).

Maddi, A., Haase, E. & Scannapieco, F. Massenspektrometrische Analyse des gesamten Sekretoms und der Amylase-präzipitierten Sekretomproteine ​​von Streptococcus gordonii. J. Proteom. Bioinform. 7, 287–295 (2014).

CAS Google Scholar

Shelburne, SA 3rd et al. Ein direkter Zusammenhang zwischen der Kohlenhydratverwertung und der Virulenz beim wichtigsten humanpathogenen Streptokokken der Gruppe A. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 105, 1698–1703 (2008).

Willenborg, J., de Greeff, A., Jarek, M., Valentin-Weigand, P. & Goethe, R. Das CcpA-Regulon von Streptococcus suis offenbart neue Einblicke in die Regulierung des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels von Streptokokken durch Bindung von CcpA an zwei unterschiedliche Bindungsmotive. Mol. Mikrobiol. 92, 61–83 (2014).

Zeng, L., Martino, NC & Burne, RA Zwei Gencluster koordinieren den Galaktose- und Laktosestoffwechsel in Streptococcus gordonii. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 78, 5597–5605 (2012).

Yasuda, T. et al. Eine einzelne Aminosäuresubstitution kann den optimalen pH-Wert von DNase I für die Enzymaktivität verschieben: biochemische und molekulare Analyse der Fisch-DNase-I-Familie. Biochim. Biophys. Acta 1672, 174–183 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Jang, DS et al. Neuartiger Hochdurchsatz-Desoxyribonuklease-1-Assay. J. Biomol. Bildschirm 20, 202–211 (2015).

Artikel Google Scholar

Jakubovics, NS Speichel als einzige Nahrungsquelle bei der Entwicklung von Multispeziesgemeinschaften im Zahnbelag. Microbiol Spec 3, https://doi.org/10.1128/microbiolspec.MBP-0013-2014 (2015).

Shields, RC et al. Wirksamkeit einer marinen bakteriellen Nuklease gegen biofilmbildende Mikroorganismen, die aus chronischer Rhinosinusitis isoliert wurden. PLoS ONE 8, e55339 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Sato, Y., Okamoto, K. & Kizaki, H. gbpC- und pac-Genmutationen im Streptococcus mutans-Stamm GS-5 nachgewiesen. Oral. Mikrobiol. Immunol. 17, 263–266 (2002).

Dong, Y., Chen, YY, Snyder, JA & Burne, RA Isolierung und molekulare Analyse des Genclusters für das Arginin-Deiminase-System aus Streptococcus gordonii DL1. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 68, 5549–5553 (2002).

Kawarai, T., Narisawa, N., Suzuki, Y., Nagasawa, R. & Senpuku, H. Die Bildung von Streptococcus mutans-Biofilmen hängt von extrazellulärer DNA unter primär niedrigen pH-Bedingungen ab. J. Oral. Biowissenschaften. 58, 55–61 (2016).

Artikel Google Scholar

Tsutsumi, K., Maruyama, M., Uchiyama, A. & Shibasaki, K. Charakterisierung eines Saccharose-unabhängigen In-vitro-Biofilmmodells von supragingivaler Plaque. Oral. Dis. 24, 465–475 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Kreth, J., Zhu, L., Merritt, J., Shi, W. & Qi, F. Rolle von Saccharose für die Fitness von Streptococcus mutans. Oral. Mikrobiol. Immunol. 23, 213–219 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Petersen, FC, Tao, L. & Scheie, AA DNA-Bindungs-Aufnahme-System: eine Verbindung zwischen Zelle-zu-Zelle-Kommunikation und Biofilmbildung. J. Bakteriol. 187, 4392–4400 (2005).

Artikel CAS Google Scholar

Nur, A. et al. Auswirkungen von extrazellulärer DNA und DNA-bindendem Protein auf die Entwicklung eines Streptococcus intermedius-Biofilms. J. Appl. Mikrobiol. 115, 260–270 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Moraes, JJ et al. Das Zweikomponentensystem VicRK reguliert Funktionen, die mit der Etablierung von Streptococcus sanguinis in Biofilmen verbunden sind. Infizieren. Immun. 82, 4941–4951 (2014).

Artikel Google Scholar

Jakubovics, NS Talk of the Town: Interspezies-Kommunikation in oralen Biofilmen. Mol. Oral. Mikrobiol. 25, 4–14 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Nijland, R., Hall, MJ & Burgess, JG Ausbreitung von Biofilmen durch abgesonderte, Matrix abbauende, bakterielle DNase. PLoS ONE 5, e15668 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Rainey, K., Michalek, SM, Wen, ZT & Wu, H. Glykosyltransferase-vermittelte Biofilmmatrixdynamik und Virulenz von Streptococcus mutans. Anwendungsumgebung. Mikrobiol. 85, e02247–02218 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Podbielski, A., Spellerberg, B., Woischnik, M., Pohl, B. & Lütticken, R. Neuartige Serie von Plasmidvektoren für die Geninaktivierung und Expressionsanalyse in Streptokokken der Gruppe A (GAS). Gene 177, 137–147 (1996).

Artikel CAS Google Scholar

Kiedrowski, MR et al. Nuklease moduliert die Biofilmbildung in gemeinschaftsassoziiertem Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus. PLoS One 6, e26714 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Robinson, JC et al. ArcR moduliert die Biofilmbildung im Zahnbelag-Besiedler Streptococcus gordonii. Mol. Oral. Microbiol 33, 143–154 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Sambrook JRD Molekulares Klonen: ein Laborhandbuch, 3. Auflage. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001).

Samarian, DS, Jakubovics, NS, Luo, TL & Rickard, AH Verwendung eines Hochdurchsatz-In-vitro-Mikrofluidiksystems zur Entwicklung oraler Multispezies-Biofilme. JoVE, 52467 (2014).

Brown, JM, Blunk, B., Williams, P. & Hardie, KR Mikrofluidikbasiertes Wachstum und Bildgebung bakterieller Biofilme. Bio-Protokoll. 9, e3460 (2019).

Artikel Google Scholar

Gale, EF & Folkes, JP Die Assimilation von Aminosäuren durch Bakterien. XV. Wirkungen von Antibiotika auf die Nukleinsäure- und Proteinsynthese bei Staphylococcus aureus. J. Biochem. 53, 493–498 (1953).

Artikel CAS Google Scholar

Mutha, NVR et al. Transkriptionsreaktionen von Streptococcus gordonii und Fusobacterium nucleatum auf die Koaggregation. Mol. Oral Mikrobiol. 33, 450–464 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde vom Innovation in Oral Care Award (NSJ) der International Association for Dental Research (IADR) und vom Dunhill Medical Trust (RPGF1810\101) (NSJ/AHN/KJW) finanziert. KJW wurde vom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/S006818/1) finanziert. Die Promotionsfinanzierung für CL erfolgte durch die National Institutes of Health (DE016690). Wir danken Ekaterina Kozhevnikova und Philip Hardy für technische Unterstützung und der Newcastle University Protein and Proteome Analysis (NUPPA) Core Facility für ihre Unterstützung bei der Enzymreinigung.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Nadia Rostami, Robert C. Shields.

School of Dental Sciences, Fakultät für Medizinische Wissenschaften, Newcastle University, Newcastle, Großbritannien

Nadia Rostami, Robert C. Shields, Sufian Yassin, Halah Ahmed und Nicholas S. Jakubovics

Abteilung für Biowissenschaften, Arkansas State University, Jonesboro, AR, USA

Robert C. Shields

Bristol Dental School, Universität Bristol, Bristol, Großbritannien

Hannah J. Serrage, Catherine Lawler, Jane L. Brittan und Angela H. Nobbs

Abteilung für Restaurierungswissenschaften, University of Alabama in Birmingham, Birmingham, AL, USA

Sufian Yassin

Einrichtung für Protein- und Proteomanalyse, Fakultät für Medizinische Wissenschaften, Universität Newcastle, Newcastle, Großbritannien

Achim Treumann & Paul Thompson

KBI Biopharma BV, Leuven, Belgien

Achim Treumann

Biowissenschaftliches Institut, Fakultät für Medizinische Wissenschaften, Newcastle University, Newcastle, Großbritannien

Kevin J. Waldron

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Von NSJ, NR, AN, AT, KJW und RCS entworfene Experimente; NR, RCS, SY, CL, JLB, PT und HA führten Experimente durch; NSJ, NR, AN, AT, KJW und RCS analysierten und interpretierten die Daten; NR, RCS und NSJ haben das Manuskript verfasst; Alle Autoren überprüften das Manuskript kritisch und genehmigten die endgültige eingereichte Version. NR und RCS trugen gleichermaßen zu der Arbeit bei.

Korrespondenz mit Nicholas S. Jakubovics.

Die Newcastle University besitzt das Patent WO2011098579A1 „Bakterielle Desoxyribonuklease-Verbindungen und Methoden zur Zerstörung und Vorbeugung von Biofilmen“. Es bestehen keine weiteren konkurrierenden Interessen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Rostami, N., Shields, RC, Serrage, HJ et al. Interspezies-Konkurrenz in oralen Biofilmen, vermittelt durch die extrazelluläre Desoxyribonuklease SsnA von Streptococcus gordonii. npj Biofilms Microbiomes 8, 96 (2022). https://doi.org/10.1038/s41522-022-00359-z

Zitat herunterladen

Eingegangen: 15. November 2021

Angenommen: 21. November 2022

Veröffentlicht: 12. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-022-00359-z

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt