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Apr 19, 2023

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Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 1539 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Fossilisierungsprozesse und insbesondere die Rolle der bakteriellen Aktivität bei der Konservierung von organischem Material sind noch nicht gut verstanden. Hier berichten wir über die Ergebnisse kontrollierter taphonomischer Experimente mit Krebsen in Süßwasser und Sedimenten. 16S-rRNA-Amplikonanalysen zeigten, dass die Entwicklung der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft im Laufe der Zeit mit verschiedenen Stadien des Zerfalls und der Erhaltung korreliert. Drei dominierende Gattungen, Aeromonas, Clostridium und Acetobacteroides, wurden als Hauptursachen für die Zersetzung von Flusskrebsen im Süßwasser identifiziert. Mittels Mikrocomputertomographie (µ-CT), Rasterelektronenmikroskopie (REM) und konfokaler Raman-Spektroskopie (CRS) wurden Calcitcluster nach 3–4 Tagen in Krebskadavern während ihrer Zersetzung in Süßwasser bei 24 °C nachgewiesen. Die Ausfällung von Calcit-Clustern während des Zersetzungsprozesses war in Gegenwart der Bakteriengattung Proteocatella erhöht. Folglich könnte Proteocatella eine der Bakteriengattungen sein, die für die Fossilisierung verantwortlich sind.

„Konservat-Lagerstätten“ beherbergen einen ausgeprägten Fossilienbestand aus Weichgewebe und veranschaulichen damit die Vielfalt antiker Gemeinschaften1,2. Die verschiedenen Schritte, die zur Versteinerung von Weichgewebe führen, bleiben unklar und insbesondere die Rolle der bakteriellen Aktivität ist nicht gut verstanden. Unmittelbar nach dem Tod eines Organismus beginnen autolytische Enzyme wie Lipasen, Proteasen oder Amylasen mit der Selbstverdauung der toten Zellen und es werden nährstoffreiche Flüssigkeiten freigesetzt3,4,5,6. Diese Nährstoffe unterstützen das anfängliche Wachstum von Bakterien, die dann hydrolytische Exoenzyme produzieren und die organische Substanz weiter zersetzen. Heterotropher Zerfall kann mit pH-Wert-Verschiebungen einhergehen. Es wird angenommen, dass diese pH-Wert-Verschiebungen dann zur Freisetzung von Ionen aus dem organischen Material und der Umgebung führen könnten. Freie Ionen beeinträchtigen das Bakterienwachstum weiter, führen zu einer Stabilisierung von Geweberesten und schließlich zu einer authentischen Mineralisierung7,8,9,10,11,12,13. Daher scheint die anfängliche bakterielle Aktivität eine wichtige Rolle für eine außergewöhnliche Konservierung zu spielen14,15, solange die Geschwindigkeit nachfolgender Konservierungsprozesse, z. B. durch Mineralisierung, höher bleibt als die Zersetzungsraten7,8,9,10,11,12,14. 16,17,18,19,20.

Der Großteil der Forschung konzentriert sich auf Umweltbedingungen, die entweder die Bakterienaktivität reduzieren oder die Ausfällung von Mineralien unterstützen. Die bakterielle Aktivität wird stark von abiotischen Faktoren wie Temperatur, pH-Wert, Salzgehalt oder Sauerstoff beeinflusst. Diese Parameter beeinflussen die Fähigkeit von Stämmen, einen Lebensraum erfolgreich zu besiedeln oder die Produktion spezifischer abbauender Exoenzyme entsprechend der Verfügbarkeit von Nährstoffen, Sauerstoff, Bakterienzelldichte und Bakterienwachstumsphase zu regulieren21,22,23. Exoenzyme wie Proteasen, Chitinasen oder Lipasen tragen zum Abbau von Weichgewebe bei, während andere bakterielle Stoffwechseleigenschaften (z. B. Ureaseaktivität, Aminosäurestoffwechsel, Fermentation von Zuckern unter Freisetzung organischer Säuren) direkt oder indirekt Mineralisierungsprozesse induzieren24 und dadurch beitragen können zur Erhaltung von Weichgewebe. Es wird angenommen, dass Zerfall und Mineralisierung gleichzeitig erfolgen und spezifisch für den Gewebetyp sind13,25. Der Erhalt von Weichgewebe wird häufig mit anaeroben Bedingungen in Verbindung gebracht, die die autolytische Aktivität verringern und vermutlich den mikrobiellen Abbau beeinflussen26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. Dabei ist jedoch nicht berücksichtigt, dass Bakterien verschiedene Anpassungen an Bedingungen mit reduziertem Sauerstoffgehalt zeigen. Beispielsweise bildet Pseudomonas tunicata, ein aerobes Meeresbakterium, unter aeroben Bedingungen Pseudomorphosen von Meeresembryonen, zerstört jedoch die innere Struktur der Zellen, wenn kein Sauerstoff verfügbar oder erschöpft ist31. Darüber hinaus sind einige obligat anaerobe Organismen, wie z. B. sulfatreduzierende Bakterien, in der Lage, organisches Material genauso schnell abzubauen wie aerobe Bakterien16,36. Darüber hinaus konnten taphonomische Experimente immer noch keinen Konsens über die Rolle anaerober Bedingungen für die Konservierung erzielen. Während einige Ergebnisse auf einen schnelleren Abbau von Weichgewebe unter aeroben Bedingungen hinweisen26,27,28,37, zeigen andere experimentelle Ergebnisse keine Unterschiede im Vergleich zum anaeroben Zerfall16,38 oder nur seltene Unterschiede unter verschiedenen Sauerstoffbedingungen39,40. Insbesondere wurde in einer Studie hervorgehoben, dass einige Nesseltiergewebe unter anaeroben Bedingungen noch schneller zerfielen41. Es wurde auch vermutet, dass spezifische Mineralisierungsprozesse, die durch Bakterien unter anaeroben Bedingungen ausgelöst werden, für den Gewebeerhalt wichtiger sein könnten als die Verringerung der mikrobiellen Aktivität14.

Derzeit liegen nur sehr begrenzte Erkenntnisse über den Einfluss einzelner Arten auf Zerfalls- und Konservierungsprozesse und deren Herkunft vor, sei es aus dem Mikrobiom des Tieres (Magen-Darm-/Integumentalflora) oder aus dem Biotop, in dem das Tier gestorben ist (Umwelt). Erste Ergebnisse deuteten auf einen stabilisierenden Einfluss endogener Mikroorganismen hin, die vermutlich aus der Magen-Darm-Flora bilateraler Organismen stammen34, während Eagan35 hervorhob, dass jeder Organismus ein individuelles Mikrobiom aufweist, das entweder den Erhalt unterstützen oder den Zerfall beschleunigen kann. Daher sind kontrollierte und sorgfältig konzipierte taphonomische Experimente mit Schwerpunkt auf der mikrobiellen Aktivität und den damit verbundenen organischen Veränderungen unter verschiedenen Umweltbedingungen erforderlich, um ein detailliertes Verständnis der Zerfallsprozesse zu erhalten. Die Untersuchung von Zersetzungsprozessen bietet die Möglichkeit, die Zerfallsphasen zu identifizieren, die entweder unterdrückt werden müssen oder ablaufen müssen, um die spezifischen Bedingungen zu schaffen, die für den Erhalt des Weichgewebes erforderlich sind.

Mit dieser Studie wollen wir dazu beitragen, das komplexe Zusammenspiel von Verfall und Konservierung aufzuklären, das den Weg zu einem hervorragend erhaltenen Fossil ebnet. Dies ist der erste experimentelle Ansatz, der die zeitabhängige Verschiebung der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft während des Zerfalls oder der Konservierung von Cambarellus diminutus-Kadavern in kontrollierten taphonomischen Süßwasserexperimenten durch 16S-rRNA-Amplikonanalyse analysiert. Um die Rolle der intrinsischen und extrinsischen Flora beim Abbau oder Erhalt von Weichgeweben aufzuklären, wurden die Krebse in natürlichem Seewasser und Sediment bei 24 °C inkubiert. Als Kontrolle dienten autoklaviertes Seewasser und Sediment. Unter anaeroben und aeroben Bedingungen wurde der Einfluss der Anoxie auf den Zerfall und mögliche Konservierungsprozesse untersucht (Abb. 1).

Der Versuchsaufbau wurde bei einer konstanten Temperatur von 24 °C durchgeführt. Exp. 1 wurde unter aeroben Bedingungen mit unbehandeltem Wasser und Sediment durchgeführt. Exp. 2 wurde unter aeroben Bedingungen mit sterilem Wasser und Sediment durchgeführt. Exp. 3 wurde unter anaeroben Bedingungen mit unbehandeltem Wasser und Sediment durchgeführt. Exp. 4 wurde unter anaeroben Bedingungen mit sterilem Wasser und Sediment durchgeführt.

Exemplare des noch vorhandenen Flusskrebses Cambarellus diminutus [Hobbs 1945] wurden einer in unserem Labor aufgezogenen Zuchtbeckengemeinschaft entnommen. Die Tiere wurden in 54-L-Becken mit einer Größe von 60 × 30 × 30 cm bei einer konstanten Wassertemperatur von 26 °C gehalten. Die Tanks wurden mit Leitungswasser gefüllt und mit dem Wasseraufbereiter „Biotopol C“ (JBL, GmbH & Co. KG, Neuhofen, Deutschland) angereichert, um Zink (Zn) und Blei (Pb) zu neutralisieren, Chlor (Cl) zu entfernen und Kupfer zu binden ( Cu). Die Krebse wurden ausschließlich mit „Crabs Nature“ (Sera, GmbH, Heinsberg, Deutschland) gefüttert, einem Hauptfutter für Krebse (Zutaten finden Sie in der Ergänzungstabelle 1).

144 Personen mit teilweise gefüllten Eingeweiden wurden getötet, indem sie einer Atmosphäre aus Kohlendioxid (CO2) ausgesetzt wurden. Die Proben wurden vor dem Wiegen auf einer Mikrowaage nicht getrocknet. Die Längen wurden von der vorderen Spitze des Cephalothorax bis zum Ende des Pleons ohne Telson gemessen (Ergänzungstabelle 2a, b). Informationen zur systematischen zoologischen Position und zum allgemeinen Aufbau der Kutikula von Cambarellus diminutus sowie zum Mauserzyklus finden Sie in den ergänzenden Informationen (Ergänzende Abbildungen 1 und 2).

In der Studie wurden vier verschiedene Versuchsaufbauten bei einer konstanten Temperatur von 24 °C durchgeführt (Abb. 1 und ergänzende Abb. 3). Zwei Experimente wurden unter aeroben Bedingungen gestartet, wobei ein Experiment mit unbehandeltem Seewasser und Sediment (Exp. 1) und das andere mit sterilem Wasser und Sediment (Exp. 2) durchgeführt wurde. Zwei weitere Experimente wurden ebenfalls mit unbehandeltem (Exp. 3) und sterilem Sediment und Wasser (Exp. 4) durchgeführt, aber anaerobe Bedingungen wurden durch spezielle Gaserzeugungssysteme hergestellt (Abb. 1).

Für alle Experimente wurden 184 sterile Falcon-Röhrchen (50 ml) mit ca. 6 g küstennahem Sediment gefüllt, das aus einem Süßwassersee namens „Alte Tongrube“ in Bonn-Röttgen, Deutschland (50°40′24,7″N/7°04 ′29,6″E). Jeweils 144 Exemplare wurden in einem dieser Falcon-Röhrchen auf das Sediment gelegt und 40 Falcon-Röhrchen blieben ohne Krebsexemplar und dienten als Blindprobe. Alle Röhrchen waren mit ca. 40 ml Seewasser gefüllt, das aus derselben Gegend stammte. Für sterile Experimente (Versuch 2 und 4) wurden Wasser und Sediment mindestens 20 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert. Alle Experimente wurden unter einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt. Experimente unter anaeroben Startbedingungen (Exp. 3 und 4) wurden mit der Zugabe von 10 mM β-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, GER) als Reduktionsmittel vorbereitet. Anaerobe Bedingungen wurden mit den Gaserzeugungssystemen BD Difco™ GasPak™ EZ Anaerobier Pouch System (BD Becton, Dickinson and Company, USA) hergestellt. Jedes Experiment hatte sieben Probenahmetage (Tag 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21), an denen morphologische Veränderungen von zwei Tieren analysiert wurden. Dabei wurde auf die Farbe der Kutikula, Gasansammlungen und Exartikulationen geachtet. Anschließend wurden die Proben präpariert und mit einem Stereomikroskop untersucht (Stemi 2000; Carl Zeiss Microscopy Deutschland GmbH, Oberkochen, Deutschland). Der Fokus der Analyse während der Präparation lag auf inneren Veränderungen der folgenden Organe: Kiemen, Verdauungsdrüse, Magen, Darm, ventraler Nervenstrang und Muskelgewebe (Abb. 2). Das Bild des Calcit-Konglomerats in Abb. 3 wurde mit einem Stereo-Zoom-Mikroskop (Axio Zoom. V16, Carl Zeiss Microscopy Deutschland, Oberkochen, Deutschland) fotografiert. Die endgültigen Figuren wurden mit Adobe Photoshop CS5 (Adobe, Dublin, Republik Irland) mit 300 dpi erstellt.

Zeitabhängige Häufigkeit dominanter Gattungen und optischer Zerfall von Körperbereichen und inneren Organen verwesender Krebse über einen Zeitraum von 21 Tagen bei 24 °C.

Kalzitniederschlag im Inneren zersetzender Krebse. (a) Mittelwert der Zunahme des Gesamtvolumens an Calcit von Exp. 1–4 für eine Dauer von 21 Tagen bei einer konstanten Temperatur von 24 °C, einschließlich eines durchscheinenden 3D-Modells eines Individuums, das rekonstruierte 3D-Modelle von Calcit-Clustern an der Innenseite der Kutikula zeigt (gelbe Strukturen). (b) Repräsentative Raman-Spektren beobachteter Kristallcluster im Vergleich zu Raman-Referenzspektren von kristallinem Apatit, Aragonit und Calcit, entnommen aus der RRUFF-Raman-Datenbank (#R060070, 0R060070, *R04017042). Raman-Spektren der Kristallcluster zeigen Haupt-Raman-Banden, die typisch für kristallisierten Calcit und das β-Carotin Astaxanthin sind. (c) Optisches Bild eines halbkreisförmigen Calcit-Clusters mit drei mineralisierten Borsten (rosa Pfeile). (d) SEM-Bild des in (c) gezeigten Calcit-Clusters.

Drei weitere Krebsproben wurden zur DNA-Extraktion verwendet, um die mikrobiologischen Veränderungen zu analysieren. Um die Veränderungen im Mikrobiom und im umgebenden Wasser und Sediment in Abwesenheit von Krebsen zu überwachen, wurden an den Tagen 1, 7, 14 und 21 Leerproben ohne Gewebe durchgeführt und alle Tests wurden in dreifacher Ausführung als Kontrollen durchgeführt. Zu Beginn jedes Experiments waren die Kadaver vollständig artikuliert und blau gefärbt. Darüber hinaus wurden auf den Schlachtkörpern keine symbiotischen, parasitären oder kommensalen Organismen gefunden.

Vor der DNA-Extraktion wurden Wasserproben mit PORAFIL® NC-Filtern (d = 0,25 µm; Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, GER) gefiltert. Anschließend wurden die Filter in kleine Stücke geschnitten und mit 750 µL ZymoBIOMICS-Lyselösung in ZR BashingBead™-Lyseröhrchen (0,1 und 0,5 mm) überführt. Das Perlenschlagen von Filtern und Gewebeproben wurde mit einem Precellys®-Homogenisator (Bertin Technologies SAS, Montigny Le Bretonneux, FR) bei 6000 × g für 30 s durchgeführt. Die DNA wurde mit dem ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep Kit (Zymo Research, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die DNA wurde in 50 µL DNase/RNase-freiem Wasser eluiert und die DNA-Konzentration in ng pro µL wurde mit einem NanoDrop™ OneC Microvolume-UV/VIS-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) bestimmt.

Für die 16S-rRNA-Gensequenzierung wurde die variable V4-Region der 16S-rRNA-Gensequenz mit den spezifischen 16S-Primern 16s-515F (GTG CCA GCM GCC GCG GTA A) und 16s-806R (GGA CTA CVS GGG TAT CTA AT)43 amplifiziert . Die PCR-Reaktion wurde als einstufige PCR mit dem HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, USA) durchgeführt und umfasste eine anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von 30–35 Zyklen bei 95 °C für 30 Sekunden. 53 °C für 40 s und 72 °C für 1 min, mit einem letzten Verlängerungsschritt bei 72 °C für 10 min. Die Paired-End-Sequenzierung (bTEFAP®) wurde von Molecular Research DNA (http://www.mrdnalab.com, Shallowater, USA) auf einem MiSeq gemäß den Richtlinien des Herstellers durchgeführt44. Sofern nicht anders angegeben, wurden Rohsequenzdaten über QIIME245 mit Standardparametern verarbeitet. Die DADA2-Pipeline wurde zur Sequenzqualitätskontrolle, Rauschunterdrückung und chimären Filterung verwendet46. Die Taxonomieklassifizierung der endgültigen ASVs (Amplikon-Sequenzierungsvariante), geclustert bei 99 % Identität, wurde mit einem naiven Bayes'schen Klassifikator durchgeführt, der speziell für die 515F/806R-rRNA-Region mit der SILVA-Datenbankversion 138 trainiert wurde47,48.

An jedem Probenahmetag wurden Wasser- und Gewebeproben für die Kultivierung von Bakterienarten vorbereitet. Kurz gesagt, die Oberfläche des Krebsgewebes wurde abgewischt, um biofilmbildende Arten zu isolieren. Der Abstrich wurde in Trypton-Soja-Brühe (TSB)-Medium plus 1 % Glucose in zehn verschiedenen Verdünnungen für 3 Tage bei 30 °C inkubiert und dann auf Columbia-Agar mit 5 % Schafsblut (COL [BD™, Becton, Dickinson and Company, New Jersey, USA]) zur weiteren Kultivierung. Zusätzlich wurden 50 µL der Wasserproben auf selektiven Agarplatten (z. B. R-2A [Sigma-Aldrich, St. Louis, USA], MacConkey-Agar [BD™, Becton, Dickinson and Company, New Jersey, USA], minimales LB-Medium [2,5 g/L Trypton, 2,5 g/L NaCl, 1,25 g/L Hefeextrakt, 18 g/L Agar, pH 7,5]) und bis zu 1 Woche bei 30 °C inkubiert. Eine weitere Isolierung wurde auf COL-Agar durchgeführt. Reinkulturen wurden mittels Matrix-unterstützter Laserdesorption/Flugzeit-Massenspektroskopie (Microflex® LT MALDI-TOF/MS Bruker Corporation, Billerica, USA) oder 16S-rRNA-Gensequenzierung identifiziert. Die Sequenzierung wurde von der GATC Biotech AG (GER) durchgeführt und die Sequenzen wurden mit der EZBioCloud-Datenbank49 verglichen.

Die Analyse der Alpha-Diversitätsmetriken wurde mit dem R-Paket „vegan“ (Version 2.5.650) durchgeführt. Visualisierungen der Statistiken und der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft wurden mit dem R-Paket „ggplot2“51 durchgeführt.

Während der ersten 4 Tage wurden drei Exemplare von Exp. 1 bis 4 (E1-21.1 bis E1-21.3; E2-21.1 bis E2-21.3; E3-21.1 bis E3-21.3; E4-21.1 bis E4-21.3) wurden zunächst einmal täglich gescannt, gefolgt von Scans nach 7, 14 und 21 Tage mit einem Mikrocomputertomographen (µ-CT) phoenix|x-ray v|tomex s 240 (GE Measurement & Control, GER) am Institut für Geowissenschaften der Universität Bonn. Jeder Datensatz hat eine Auflösung von 38 µm; Die Scans wurden bei 80 kV und 100 µA durchgeführt. Drei Bilder pro Projektion wurden mit einem Timing von 500 ms für insgesamt 1000 Projektionen erfasst. µ-CT-Daten wurden mit der Software VG Studio Max 3.2 (Volume Graphics, Heidelberg, Deutschland [https://www.volumegraphics.com/de/produkte/vgsm/whats-new-in-vgstudio-max-3-2) verarbeitet -x.html]) und Avizo 8.0 (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland [https://www.thermofisher.com/de/de/home/electron-microscopy/products/software-em-3d-vis/avizo- software.html]), um ausgefällte Kristallcluster in den Proben und Gastrolithen im Magen zu rekonstruieren und sichtbar zu machen. Darüber hinaus wurde Avizo 8.0 für Volumenmessungen von polygonalen 3D-Oberflächenmodellen verwendet.

Kristallcluster (falls vorhanden) wurden aus den Kadavern gewonnen und mit einem konfokalen Raman-Spektrometer LabRam HR800 (Horiba Scientific) am Institut für Geowissenschaften der Universität Bonn analysiert. Als Anregungsquelle wurden ein 100 mW 784 nm Diodenlaser, ein Gitter mit 600 Rillen/mm und ein 100 × Objektiv mit einer numerischen Apertur von 0,9 verwendet. Die konfokale Lochgröße und die Spektrometer-Eintrittsspaltgröße wurden auf 1000 bzw. 100 µm eingestellt. Mit diesen Einstellungen betrug die spektrale Auflösung 4,6 cm−1. Die Gesamtbelichtungszeit betrug 2 Minuten mit vier Akkumulationen von 30 Sekunden.

Kristallcluster (sofern vorhanden) wurden zerlegt und mit einem Kaltsputterbeschichter (Cressington Sputter Coater 108 Handbuch, Tescan GmbH, Dortmund, Deutschland) mit einer dünnen Goldschicht beschichtet. Anschließend wurden die Proben mit einem „Umwelt“-Rasterelektronenmikroskop (REM) (TESCAN VEGA 4 LMU) unter Verwendung des SE-Detektors bei 20 keV gescannt. Bilder haben 1536 × 1331 Pixel und 16 Bit. Den Arbeitsabstand der einzelnen REM-Aufnahmen finden Sie in den Bildunterschriften.

In unbehandeltem Seewasser unter aeroben Bedingungen (Exp. 1) wurde am 2. Tag eine Farbveränderung der Nagelhaut und ein starker Fäulnisgeruch beobachtet. Vergleichbare Beobachtungen wurden in sterilisiertem Seewasser unter aeroben (Exp. 2) und anaeroben Bedingungen (Exp. 2) gemacht . 4) nach 3 Tagen und auch nach 4 Tagen unter anaeroben Bedingungen in unbehandeltem Seewasser (Exp. 3) (Abb. 2 und Ergänzungstabelle 3). Am siebten Tag wirkten die Nagelhaut der Flusskrebse in allen Experimenten weich und geleeartig.

Unter anaeroben Bedingungen (Versuch 3 und 4), unabhängig von der Aufbereitung des Wassers, zeigten die zunächst weißen Muskeln am dritten Tag eine rosa Verfärbung, während in Experimenten, die unter aeroben Bedingungen begannen (Versuch. 1 und 2).

Bei allen Individuen aller Experimente kam es innerhalb der ersten 4 Tage zu einer Zersetzung des Magens (Abb. 2), ebenso wie bei den unter anaeroben Bedingungen inkubierten Individuen auch der Verdauungsdrüse. Unter aeroben Bedingungen konnte die Verdauungsdrüse für mindestens eine Woche identifiziert werden. Nach dieser Zeit waren die Muskeln breiig und die Nagelhaut durchscheinend und geleeartig. Der ventrale Nervenstrang, der Darm und die Kiemen waren bei keinem der Tiere mehr sichtbar, mit Ausnahme der Kiemen bei Individuen von Exp. 2 (aerob, steril) (Abb. 2), die bis zum 14. Tag sichtbar waren.

Nach 2 Wochen sind das Sediment und die Kadaver von Exp. 1 bis 3 waren von einer schwarzen Schicht bedeckt, die in Exp. erschien. 4 (anaerob, steril) erst nach 21 Tagen. Darüber hinaus wurde bei Individuen von Exp eine Ansammlung von Fäulnisgas im Bereich der Kiemen festgestellt. 1 (aerob, unbehandelt), was am 24. Tag, 3 Tage nach dem regulären Studienzeitraum, zu einem abgelösten schwebenden Cephalothorax des Individuums E1-21.1 führte (ergänzende Abbildung 4a). Der Cephalothorax des Individuums E1-21.3 löste sich ebenfalls am 24. Tag nur teilweise vom Pleon und schwebte mit den Überresten des baumelnden Körpers (ergänzende Abbildung 4b).

In keinem Exemplar der anderen Experimente wurde eine Gasansammlung festgestellt, wir beobachteten jedoch eine Trennung des Pleons vom Cephalothorax bei Individuen von Exp. 2 (aerob, steril) nach 7 Tagen und in Krebsproben von Exp. 3 (anaerob, unbehandelt) nach 2 Wochen.

Um die zeitliche Abfolge der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft (MCC) in den vier Experimenten zu analysieren, führten wir zu sieben Zeitpunkten eine 16S-rRNA-Amplikonsequenzierung mit drei unabhängigen biologischen Replikaten durch. Die bakterielle Abfolge innerhalb der Triplikate war vergleichbar und ermöglichte eine Interpretation unterschiedlicher Tendenzen. Der MCC des Sediments war über die Jahreszeiten hinweg stabil (Ergänzungstabelle 4). Die über den Shannon-Index52 berechnete α-Diversität nahm unter allen Bedingungen innerhalb der ersten 3 Tage ab. In den Kontrollexperimenten (Exp. 2: aerob, steril; Exp. 4: anaerob, steril) blieb die Diversität stabil um einen Shannon-Index von ~ 1,5, während in den Experimenten mit dem natürlichen Seewasser bis dahin ein leichter Anstieg festgestellt werden konnte das Ende der Experimente (vgl. Ergänzungstabelle 5; Ergänzungsabbildung 5). In allen Experimenten waren die Proben der ersten Tage durch hohe Mengen an Proteobakterien gekennzeichnet, aber nach 4 Tagen dominierten die Phyla Firmicutes und Bacteroidetes (vgl. Ergänzungstabelle 6). Nach Verbrauch des Restsauerstoffs übernahmen in allen Proben obligat anaerobe Bakterien die Oberhand. Der MCC in den Experimenten mit unbehandeltem Seewasser und Sediment (Versuch 1 und Versuch 3) wurde zunächst von Aeromonas sp. dominiert. Diese Bakterien waren bereits am ersten Tag auf den Tieren vorhanden (Ergänzungstabelle 7). Die Aeromonaden wurden von Clostridium sp. verdrängt. im mittleren Teil des Experiments. Nachdem der Magen und die Verdauungsdrüse der Krebsindividuen zusammengebrochen waren, vermehrten sich Arten der Gattung Acetobacteroides. Geringe Häufigkeit von Proteocatella sp. wurden in Exp gefunden. 1 (aerob, unbehandelt) und Exp. 3 (anaerob, unbehandelt), wohingegen diese Gattung in den sterilen Kontrollen fehlte (Versuch 2 und Versuch 4). Hier unterschieden sich die MCCs voneinander. Exp. 4 (anaerob, steril) zeigte eine vergleichbare bakterielle Progression wie Exp. 1 und Exp. 3 (beide unbehandelt), obwohl Aeromonas sp. zeigte in beiden Kontrollexperimenten (Exp. 2 und Exp. 4) eine biphasische Blüte, also einen vorübergehenden Rückgang, der mit einem Anstieg von Clostridium sp. einherging. für ein paar Tage. Der anfängliche Zerfall in Exp. 4 (anaerob, steril) zeigte das Vorhandensein von Candidatus Bacilloplasma sp. und Bacillus sp., wohingegen die zersetzenden Tiere von Exp. 2 (aerob, steril) wurden in den Endproben von sporenbildenden Bakterien der Gattung Sporobacter (Gruppe Ruminococcaceae NK4A214) und Ruminiclostridium besiedelt (Abb. 2 und Ergänzungstabelle 8 für MMC aller Gattungen). Isolierte Bakterienstämme und ihre Eigenschaften sind in der Ergänzungstabelle 9 aufgeführt.

µ-CT-Bilder zeigten die Ausfällung von Kristallclustern in allen Versuchsaufbauten, beginnend in den Chelipeds der einzelnen Probe E2-21.2 in Exp. 2 bereits nach 2 Tagen bzw. nach 3 Tagen bei den Exemplaren E2-21.3, E3-21.2 und E4-21.3. Nach 4 Tagen waren bei allen Individuen Kristallcluster ausgefällt (Ergänzungstabelle 10a). Während der Zerfall voranschritt, wurden kristalline Strukturen an der ventralen Seite des Cephalothorax, innerhalb der Pereiopoden, innerhalb der Coxa der Pleopoden, entlang der ventrolateralen Seite der Tergite, im Telson und bei den Uropoden beobachtet. Darüber hinaus zeigten µ-CT-Bilder, dass sich diese Kristallcluster nur an der Innenseite der Kutikula ablagerten. Alle gescannten Exemplare von Exp. 1 (aerob, unbehandelt) und Exp. 2 (aerob, steril) enthielt ein Paar Gastrolithen. Volumenmessungen von polygonalen 3D-Oberflächenmodellen von Kristallclustern und Gastrolithen zeigten eine Zunahme des Volumens von Kristallclustern und gleichzeitig eine Volumenverringerung der Gastrolithe mit fortschreitendem Zerfall (Ergänzungstabelle 10b). Wichtig ist, dass in Experimenten, die unter sterilen Bedingungen durchgeführt wurden (Versuch 2 und Versuch 4), im Vergleich zu Experimenten, die mit unbehandeltem Sediment und Wasser durchgeführt wurden (Versuch 1 und Versuch 3), ein geringeres Gesamtvolumen an Kristallclustern beobachtet wurde. Darüber hinaus ist das Gesamtvolumen der Kristallcluster in Exp. 4 (anaerob, steril) nahm vor Versuchsende ab (Abb. 3a).

Raman-Analysen ergaben eindeutig, dass die Kristallcluster aus wohlgeordneten Calcitkristallen bestanden (Abb. 3b), die durch die vollständig symmetrische v1(CO3)-Streckschwingungsbande nahe 1085 cm−1 sowie das Vorhandensein von Banden nahe 154 identifiziert werden können und 281 cm−1, die Calcit-Gitterschwingungen zugeordnet werden, wobei letztere in amorphem Calciumcarbonat (ACC) fehlen. Darüber hinaus zeigten einige Raman-Analysen der Kristallcluster ein gemischtes Spektrum mit Grundbanden aus kristallinem Calcit und dem β-Carotin Astaxanthin (AXT) (Abb. 3b), das durch die typischen Hochintensitätsmoden nahe 1157 und 1517 cm− identifiziert wurde 1, die den C=C- bzw. C-C-Streckschwingungen der Polyenkettenbindungen zugeordnet werden53,53,55. Im Vergleich zum vom AXT-Standard erhaltenen Spektrum wurde eine kleine, aber deutliche Abweichung in der Frequenz der ~ 1517 cm−1-Bande beobachtet, die vermutlich mit den strukturellen Unterschieden im AXT in Verbindung gebracht werden kann.

SEM-Bilder zeigten am Ende des Experiments mehrere Strukturen ausgefällter Calcitcluster (Ergänzende Abbildung 6a – f), deren Größe zwischen 100 und 900 µm variierte. Eine Calcitstruktur wurde in einem Pereiopoden des Individuums E1-21.3 mit mineralisierten Kutikularesten und drei Plumose-Setae gefunden (Abb. 3c, d). Die meisten Calcitcluster waren kugelförmig (ergänzende Abbildung 6d) oder bisphärisch. Einige Kristallcluster waren mehr oder weniger elliptisch mit einer oder zwei abgerundeten Verdickungen an einem Ende (ergänzende Abbildung 6c, e, f). Alle Calcitstrukturen zeigten rötliche Verfärbungen und wurden auf der Innenseite der Nagelhaut entdeckt (Abb. 3c und ergänzende Abb. 6a).

Dies ist die erste detaillierte Untersuchung der Bakterienfolge beim Zerfall von Weichgewebe und der Erhaltung von Arthropoden im Süßwasser. Die mikrobiellen Analysen während des Zerfalls des Flusskrebses C. diminutus unter verschiedenen vordefinierten Parametern zeigten in allen Experimenten reproduzierbare Gemeinschaftssukzessionen. Die fakultativ anaeroben Bakterien, die zu Beginn unserer Experimente das Gewebe dominierten und sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Sauerstoff wachsen konnten, wurden schnell von obligat anaeroben Organismen verdrängt. Ähnliche Verschiebungen wurden auch in der Forensik für den terrestrischen Verfall von Mäusen, Schweinen und Menschen beschrieben56,56,57,59. Nach 7 Tagen verändert sich die Bakterienflora häufig aufgrund einer Abnahme der Nährstoffe und der Notwendigkeit alternativer Stoffwechselwege zur Energieerzeugung60, was auch in Exp. festgestellt wurde. 1 (aerob, unbehandelt), Exp. 3 (anaerob, unbehandelt) und Exp. 4 (anaerob, steril). Anfangs wurden die verwesenden Kadaver vom Stamm Proteobacteria bewohnt, später wurden hauptsächlich Firmicutes und Bacteroidetes nachgewiesen (siehe Ergänzungstabelle 6)58,61,62. Das Mikrobiom der verwesenden Flusskrebse umfasste drei dominierende Gattungen: Aeromonas, Clostridium und Acetobacteroides. In allen Experimenten besiedelte die Gattung Aeromonas die Kadaver in der Anfangsphase und erreichte am 2. und 3. Tag maximale Bestände. Diese fakultativ anaeroben Wasserbakterien kommen allgegenwärtig vor63 und spielen eine wichtige Rolle bei der Zersetzung von Kadavern in Süß- und Brackwasser64,65. Sie sind auch Krankheitserreger, die Infektionen bei Fischen und anderen Tieren sowie bei immungeschwächten Menschen verursachen66. Die pathogenen Arten A. hydrophila, A. salmonicida und A. veronii wurden aus den Experimenten isoliert und bestätigen die herausragende Rolle von Aeromonas beim Zerfall von Wasserorganismen, wie Lobb62 für Fische gezeigt hat. Viele der Isolate waren Biofilmbildner. Dominanz von Aeromonas sp. im anfänglichen Zerfallsprozess kann durch die Sekretion verschiedener Exoenzyme wie spezifischer Hämolysine, Proteasen, Chitinasen oder Lipasen erklärt werden, die zur Lyse der Wirtszelle beitragen62,67,67,68,69,71.

Nach 2 oder 3 Tagen stieg die Menge an Clostridien in allen Experimenten gleichzeitig mit einem Rückgang an Aeromonas an und erreichte am 7. Tag ihr Maximum. Clostridien werden mit anaeroben Infektionen und dem Zerfall von menschlichem und tierischem Gewebe in Verbindung gebracht30,58,61,62,72 und kommen häufig im Magen-Darm-Trakt verschiedener Organismen und im Boden vor73,74. Da sie auch in den sterilen Kontrollen vorhanden waren und selten im Sediment nachgewiesen werden konnten (siehe Ergänzungstabelle 4), müssen sie aus dem Magen-Darm-Trakt der Krebsindividuen oder Sporen stammen, die auf der Körperoberfläche vorhanden waren. Diese Gattung wird auch häufig in forensischen Experimenten nachgewiesen56,58,60,61. Einige Arten dieser Gattung sind in der Lage, Kollagen und Hyaluronsäure zu spalten und Toxine zu produzieren, die Zellmembranen zerstören, was zur Freisetzung frischer Nährstoffe aus den toten Körpern führt75,75,76,78. Daher könnte ein Mangel an Nährstoffen zum Rückgang der Aeromonaden beigetragen haben, die den Kadaver ursprünglich besiedelt hatten. Anoxia war entweder Teil des Versuchsaufbaus in Exp. 3 und Exp. 4 oder durch mikrobielle Aktivität in Exp entwickelt. 1 und Exp. 214. Später wurde in allen Experimenten Aeromonas sp. und Clostridium sp. wurden nach Tag 7 von Rikenellaceae (Acetobacteroides sp.) verdrängt, außer in Exp. 2 (aerob, steril), in der diese Gattung fehlte und eine sekundäre Zunahme von Aeromonaden beobachtet wurde. Acetobacteroides spp. sind streng anaerob und fermentieren polymere Zucker (Glykogen), Hexosen, Pentosen und Trypton zu Acetat, CO2 und H279. Die Zunahme dieser Gattung erfolgte gleichzeitig mit dem Zusammenbruch des Magens und der Verdauungsdrüse, einem Speicherorgan für Glykogen bei Krebstieren80, was darauf hindeutet, dass die Freisetzung von Substraten durch den Abbau dieser nährstoffreichen Organe die Proliferation von Acetobacteroides sp. unterstützt haben könnte. oder dass diese Gattung ein natürlicher Bewohner dieser Körperteile ist. Der Darm der orientalischen Flussgarnele Macrobrachium nipponense, einer Art aus der Ordnung der Decapoda wie C. diminutus, beherbergt Vertreter von Acetobacteroides81. Es wird darauf hingewiesen, dass auch die Gewebekontrollen am ersten Tag verwandte Arten aufwiesen (siehe Ergänzungstabelle 7) und daher das Fehlen von Acetobacteroides in Exp. 2 ist überraschend.

Die Ausfällung von Mineralien ist oft ein wichtiger Schritt bei der Erhaltung von Weichkörperorganismen82. In allen Experimenten wurde die Ausfällung von Calcitkristallen an der Innenseite der Krebspanzer festgestellt, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß. In Exp. 1 und 3 (unbehandelt) wurde unabhängig vom Sauerstoffgehalt ein höheres Calcitvolumen ausgefällt als in Exp. 2 und 4 (steril) (Abb. 3a). Das Gesamtvolumen an Calcit (TVC) in Exp. 4 nahm am Tag 7 sogar ab, was durch eine Ansäuerung des pH-Werts durch mikrobielle Aktivität im Inneren der Proben erklärt werden kann83. Es wurde festgestellt, dass der pH-Wert vom abgebauten Substrat abhängt und sich entsprechend den aktiven Stoffwechselwegen in der Probe ändern kann und wiederum die lokale chemische Umgebung und den Mineralniederschlag in taphonomischen Experimenten beeinflusst39,84,85. Bei Krebsen wurde beobachtet, dass die Ausfällung von Calcit von der Körpergröße und/oder dem Stadium der aktuellen Mauserphase abhängt83. Zu Beginn jeder Häutungsphase lösen sich Kalziumionen aus der Kutikula aus den Kutikulaschichten und werden über das hämolymphatische Kreislaufsystem in die Magenwand des Herzens transportiert. Es bilden sich Kalziumspeicherknötchen, sogenannte „Gastrolithen“, die aus einem Netzwerk von bestehen Protein-Chitin-Fasern und amorphes Calciumcarbonat (ACC)86,87. Diese Calciumionen stehen daher für die Calcitausfällung nach dem Tod nur eingeschränkt zur Verfügung83. Da sich die verglichenen Individuen jedoch selten in der Körpergröße (siehe Ergänzungstabelle 2a, b) und in den Mauserstadien (Ergänzungstabelle 10b) unterschieden, können diese Faktoren die signifikanten Unterschiede in der Calcitausfällung nicht erklären.

Die Ergebnisse der Mikrobiomsequenzierung zeigten das Vorhandensein der Gattung Proteocatella in den Proben von Exp. 1 und Exp. 3 in unbehandeltem Seewasser, wohingegen es in Exp. fehlte. 2 und Exp. 4 (sterile Kontrollen). Bisher wurde nur die Typusart Proteocatella sphenisci kultiviert. Es wurde aus den Ausscheidungen des Magellanpinguins (Spheniscus magellanicus88) isoliert, der sich von Fischen und Krebstieren ernährt. Nicht kultivierte Mitglieder der Gattung Proteocatella wurden aus Abwasser, Flüssen, Trinkwasser und Darmmikrobiota beschrieben89,89,91. Die Gattung ist jedoch auch Teil des Mikrobioms karbonisierter Thromboliten, die im flachen, subpolaren Süßwasser der Laguna Larga im Süden Chiles vorkommen92. Eine weitere interessante Tatsache ist, dass Proteocatella spp. ist als Bestandteil von Zahnbelag bei Katzen93 und Hunden94,95 bekannt, der mineralisieren und zu Zahnstein werden kann96. Daher könnten Arten der Gattung Proteocatella die Calcitausfällung in Krebskadavern von Exp. unterstützt haben. 1 und Exp. 3 und könnte eine der Gattungen sein, die für die Fossilisierung verantwortlich sind. Oscillibacter sp. und Desulfovibrio sp. waren auch in den Experimenten mit unsterilisiertem Wasser nur vorhanden, wenn auch in geringen Mengen. Beide Gattungen wurden entweder mit Mineralisierung97,97,99 oder Plaquebildung100 in Verbindung gebracht.

Es wird allgemein angenommen, dass anaerobe und insbesondere reduzierende Bedingungen den Abbau von Weichgewebe verlangsamen29,30,31,32,33,34,35, da sie autolytische Enzyme hemmen, die für anfängliche Zerfallsprozesse verantwortlich sind, externe Radikalfänger ausschließen und dadurch Bioturbation31,38,101. Allerdings wurde in unseren Experimenten das Krebsgewebe sowohl unter anaeroben als auch unter aeroben Ausgangsbedingungen vergleichbar abgebaut. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die Etablierung anaerober Bedingungen in allen Versuchsaufbauten innerhalb kurzer Zeit zurückzuführen, da eine künstliche Belüftung durch Inkubation auf einem Orbitalschüttler die Schlachtkörper zerstört hätte und daher nicht möglich war9,14,26,85. Eine weitere Erklärung für die vergleichbaren Zerfallsmuster könnte eine unzureichende Hemmung der autolytischen Aktivität in den Experimenten sein. In Gegenwart von Sauerstoff zersetzte sich der Magen nach 2 Tagen (Versuch 1, Versuch 2), während dieses Organ unter anaeroben Bedingungen im Gegensatz zur Verdauungsdrüse bis zum dritten Tag intakt blieb (Versuch 3, Versuch 4). das später in einer oxischen Umgebung zerfiel. Vor dem Zerfall zeigten die Muskeln einen Farbumschlag von Weiß nach Rosa, der unter anaeroben Bedingungen früher festgestellt wurde als unter aeroben Bedingungen, was höchstwahrscheinlich durch die Freisetzung und Diffusion von Astaxanthin (AXT) verursacht wurde, einem Pigment, das normalerweise an den α-Crustacyanin-Proteinkomplex im Körper gebunden ist Panzer lebender Krebstiere102. Tatsächlich wurde auch eine Diffusion von Astaxanthin in Calcit-Cluster beobachtet, die sich an der Innenseite der Kutikula niedergeschlagen hatten (Abb. 3b, c).

Andere Experimente konnten ebenfalls keinen16,38,39,40 oder selten einen Unterschied in der Zerfallsgeschwindigkeit unter verschiedenen Sauerstoffbedingungen feststellen. Hancy und Antcliffe41 zeigten sogar, dass einige Gewebestrukturen in Gegenwart von Sauerstoff besser erhalten bleiben. In früheren Experimenten wurden reduzierende Bedingungen durch Inkubation kleiner Organismen mit β-Mercaptoethanol34,35,103 geschaffen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Konzentration des Reduktionsmittels an die Körpergröße der Organismen angepasst werden muss, da bisherige Protokolle keine wirksame Hemmung autolytischer Prozesse gewährleisten konnten.

Das Mikrobiom von Organismen ist individuell und kann daher den Abbau und die Erhaltung unterschiedlich beeinflussen35,104 und lässt daher die Annahme eines individuellen Erhaltungspotenzials in der Natur zu. Allerdings stammten in diesen Experimenten alle Tiere aus demselben Becken und die biologischen Replikate zeigten die gleichen Tendenzen bei der mikrobiellen Abfolge und dem Gewebeabbau. Die Analyse der Herkunft abbauender oder konservierender Organismen war komplex und die meisten der dominierenden Bakterien konnten sowohl im Gewebe als auch in Wasser und Sedimenten gefunden werden. Darüber hinaus wird die Analyse der Zusammensetzung der Mikrobengemeinschaft und ihres Einflusses auf den Zerfall und die Erhaltung von Weichgewebe durch Bakterien behindert, die sich bei unterschiedlichen Umweltzusammensetzungen unterschiedlich verhalten, wie beispielsweise der marine Zersetzer P. tunicata31. Um weitere Informationen über das Verhalten von Bakterien und ihre aktiven Stoffwechselwege zu erhalten, sollte eine Transkriptomanalyse durchgeführt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unter verschiedenen Versuchsbedingungen für Cambarellus diminutus eine feste Zersetzerfolge von Aeromonas, Clostridium und Acetobacteroides beobachtet wurde, die das für Süßwasserfische beschriebene „Nekrobiom“62 genau reproduzierte. Das Vorkommen dieser Bakterien ging mit der Bildung von kristallinem Calcit in den Tieren einher und war in Gegenwart der Gattung Proteocatella besonders ausgeprägt.

Alle Rohsequenzdaten im Zusammenhang mit dieser Studie sind in der Datenbank des European Nucleotide Archive (ENA) (Europäisches Bioinformatik-Institut, EMBL-EBI), einem Kooperationspartner der International Nucleotide Sequence Database (INSDC), [Studienzugangsnummer: PRJEB51206] hinterlegt. https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB6609.

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Wir danken JA Schultz und R. Schellhorn für fruchtbare Diskussionen und wir danken T. Martin für die Bereitstellung des µ-CT-Geräts (alle Sektion Paläontologie, Institut für Geowissenschaften). Wir danken O. Dülfer, P. Göddertz, G. Oleschinski für ihre Unterstützung (alle Sektion Paläontologie, Institut für Geowissenschaften). J. Rust und G. Bierbaum werden von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert – Projekt-Nummer 386704301 im Rahmen der DFG-Forschungsgruppe FOR2685 „The Limits of the Fossil Record: Analytical and Experimental Approaches to Fossilization“ (Projektnummer). 348043586). Dies ist Beitrag Nr. 50 der DFG-Forschungsgruppe FOR2685.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Diese Autoren haben zu gleichen Teilen beigetragen: Bastian Mähler und Kathrin Janssen.

Section Paleontology, Institute of Geosciences, Rheinische Friedrich-Wilhelms Universität Bonn, 53115, Bonn, Germany

Bastian Mähler & Jes Rust

Institute of Medical Microbiology, Immunology and Parasitology, Medical Faculty, Rheinische Friedrich-Wilhelms Universität Bonn, 53127, Bonn, Germany

Kathrin Janssen & Gabriele Bierbaum

Section Geochemistry, Institute of Geosciences, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn, 53115, Bonn, Germany

Mara Iris Lönartz, Markus Lagos & Thorsten Geisler

Institute of Energy and Climate Research (IEK-6): Nuclear Waste Management, Forschungszentrum Jülich GmbH, 52428, Jülich, Germany

Mara Iris Lönartz

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BM und KJ haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen. Konzeptualisierung: JR, BM, GB Finanzierungseinwerbung: GB, JR Untersuchung: KJ, BM, MIL, ML Datenkuration: KJ, BM, TG Schreiben – Originalentwurf: KJ, BM Überprüfung und Bearbeitung: KJ, BM, MIL, ML, TG, GB

Korrespondenz mit Bastian Mähler oder Kathrin Janssen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mähler, B., Janssen, K., Lönartz, MI et al. Zeitabhängige mikrobielle Verschiebungen während der Zersetzung von Krebsen in Süßwasser und Sedimenten unter verschiedenen Umweltbedingungen. Sci Rep 13, 1539 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28713-x

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Eingegangen: 24. Juli 2022

Angenommen: 23. Januar 2023

Veröffentlicht: 27. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28713-x

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